БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ
ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ
 
КАК ПОДАТЬ РУКОПИСЬ
 
КАРТА САЙТА
НА ГЛАВНУЮ

 

 

 

 

doi: 10.15389/agrobiology.2019.2.347rus

УДК 619:578:57.083.2:577.2

 

ТЕСТ-СИСТЕМЫ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА
КАПРИПОКСВИРУСОВ И ВИРУСА ЗАРАЗНОГО УЗЕЛКОВОГО
ДЕРМАТИТА

А.В. СПРЫГИН, Я.Е. ПЕСТОВА, Е.С. КОСТРОВА, С.В. КОНОНОВА,
О.П. БЬЯДОВСКАЯ, Т.В. ЖБАНОВА, А.В. КОНОНОВ

Интенсификация животноводства неизбежно повышает риски заноса и распространения инфекционных заболеваний, из которых наиболее опасны трансграничные. Инфекции крупного рогатого скота, вызываемые каприпоксвирусами, в частности вирусом заразного узелкового дерматита (ЗУД, Lumpy skin disease, LSD), поражают крупный и мелкий рогатый скоту, нанося существенный экономический ущерб. До 2015 года территория Российской Федерации была благополучна по ЗУД, однако из-за локальных конфликтов на Ближнем Востоке и изменений климата заболевание распространяется в северном направлении (масштабные вспышки LSD в Турции, странах Балканского полуострова, ЕС и в России). Широкое использование живых гомологичных вакцин против LSD в соседних странах также актуализирует разработку методов диагностики этого возбудителя, позволяющих выявлять геномы полевых изолятов и дифференцировать вакцинный вирус ЗУД КРС. Нами впервые в России разработан и валидирован комплекс методов ПЦР в режиме реального времени для однорежимного тестирования проб на наличие генома каприпоксвирусов, полевых изолятов вируса заразного узелкового дерматита и вакцинного вируса ЗУД КРС типа Neethling. На основе выравнивания полногеномных последовательностей идентифицированы сайты, наиболее пригодные для специфичной амплификации при выявлении генома полевых изолятов, вакцинных штаммов и каприпоксвирусов. Для амплификации фрагмента генома полевых изолятов мы выбрали участок ORF126 гена EEV вируса LSD — вставку размером 27 п.н., отсутствующую у других представителей рода Capripoxvirus и вакцинных штаммов типа Neethling. Для амплификации фрагмента генома вакцинных штаммов использовали участок ORF008, в котором присутствуют уникальные замены, характерные только для таких штаммов, для каприпоксвирусов — участок гена P32, консервативный для всех представителей рода Capripoxvirus. Предложенные методы показали высокую чувствительность (98 %), специфичность (99 %) и адекватную повторяемость (коэффициент вариации не более 2 %). Апробацию тест-систем проводили на панели из 596 проб биологического материала, собранного при вспышках каприпоксвирусных инфекций в России, — стабилизированной крови, сыворотки крови, соскобов кожи (нодулы), назальных и окулярных смывов, молока, тканей лимфатических узлов, легких, трахеи, селезенки и абортплодов, отобранных от животных, инфицированных в естественных условиях. Следует отметить, что с помощью разработанного комплекса тест-систем ПЦР-РВ в рамках мониторингового исследования на заразный узелковый дерматит в ряде регионов Российской Федерации отмечены случаи выявления генома вакцинного вируса ЗУД КРС. Это может свидетельствовать либо о нелегальном использовании запрещенной к ввозу в Россию аттенуированной живой вакцины типа Neethling, либо о естественном распространении вакцинного Neethling. На основе разработанных методов оформлено два патента РФ на изобретения, что подтверждает оригинальность и значимость предложенных методик для диагностических исследований.

Ключевые слова: заразный узелковый дерматит, нодулярный дерматит, вакцинный штамм, каприпоксвирус, ПЦР, Neethling.

 

 

ONE-RUN REAL TIME PCR ASSAYS FOR THE DETECTION OF CAPRIPOXVIRUSES, FIELD ISOLATES AND VACCINE STRAINS OF LUMPY SKIN DISEASE VIRUS

A.V. Sprygin, Ya.E. Pestova, E.S. Kostrova, S.V. Kononova,
O.P. Byadovskaya, T.V. Zhbanova, A.V. Kononov

The cattle and sheep industry is economically important for sustainable growth. However, the increasing demand for livestock products drives animal population growth and risks for infection diseases. Lumpy skin disease (LSD) has recently expanded its historical range northward reaching countries that were never affected before. Prior to 2015 the territory of the Russian Federation was free of lumpy skin disease, whereas by 2017 Turkey, Serbia, Greece, Azerbaijan have reported incursions of this virus. Not only lumpy skin disease but also sheep pox has increased in incidence. Given this scenario, timely detection of these pathogens is key towards successful control and eradication. Moreover, diagnostic tools should detect both LSDV genome in the face of the use of live vaccine LSD virus strains and distinguish between the two. In this paper we report the development of a set of one-run real-time PCR assays to detect and differentiate between Capripoxvirus genome, field and vaccine LSD virus genomes. The assay for field LSD virus targets the 27 bp deletion in ORF126, the assay for vaccine LSD virus targets genetic signatures unique to Neethling vaccine strains, and the capripoxvirus assay targets the conserved P32 gene. The assays proved highly sensitive and specific. The set of PCRs was validated against a panel of 596 samples collected in the field, including whole blood, serum, skin lesions, nasal and ocular discharge, milk, lymph nodes, lungs, trachea, spleen and aborted calves. Using the assays reported here some samples obtained as part of national surveillance for LSD virus from animals exhibiting clinical signs consistent with LSDV turned out to be positive for vaccine LSD virus genome in 2017. This vaccine strain is highly likely to have derived from commercial live-attenuated vaccines against LSD virus. The way of introduction of a vaccine LSD virus strain into Russian cattle remains to be investigated.

Keywords: lumpy skin disease, vaccine, diagnostics, real-time PCR, genome, virus.

 

ФБГУ Федеральный центр охраны здоровья животных,
600901 Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГБУ ВНИИЗЖ, e-mail: spriginav@mail.ru ✉, pestova@arriah.ru, kostrova@arriah.ru,
kononova@arriah.ru, bjadovskaya@arriah.ru, zhbanova@arriah.ru, kononov@arriah.ru

Поступила в редакцию
25 сентября 2018 года

 

назад в начало