doi: 10.15389/agrobiology.2019.2.395rus
УДК 619+616.5]:57.085.23
Работа выполнялась в рамках НИР № 0578-2018-0006 «Создание новых клеточных систем с заданными свойствами на основе стволовых клеток млекопитающих, в том числе сельскохозяйственных животных для ветеринарии, вирусологии и биотехнологии».
МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ
КОШЕК И СОБАК В КУЛЬТУРЕ
И.П. САВЧЕНКОВА, С.А. ВАСИЛЬЕВА, Д.Г. КОРОВИНА,
А.А. ШАБЕЙКИН, А.М. ГУЛЮКИН
Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) рассматриваются как перспективный инструмент регенеративной медицины для лечения различных заболеваний мелких домашних животных. ММСК обладают высокой пролиферативной активностью, мультипотентными свойствами, низкой иммуногенностью, а также способностью мигрировать к поврежденной ткани и содействовать ее заживлению и регенерации. В настоящее время активно развиваются методы регенеративной медицины для решения проблем, с которыми трудно справиться альтернативными способами лечения. Однако данные о применении ММСК в клинической практике опережают работы по изучению свойств этих клеток в культуре. В связи с этим нами из внутренней жировой ткани (ЖТ) кошек и собак выделены клетки с фенотипом, подобным ММСК млекопитающих. Цель исследования, представленного в этом сообщении, заключалась в изучении культуральных свойств впервые выделенных клеток in vitro. Клетки выделяли посредством последовательной механической и ферментативной обработки жиров. Для ферментативной диссоциации ткани использовали 0,01 % раствор коллагеназы II типа на основе среды DMEM-LG («ПанЭко», Россия) с низким содержанием глюкозы (1 г/л) при 37 °С в течение 60 мин. Сравнительный анализ свойств полученных клеточных популяций выявил, что клетки, выделенные из ЖТ кошек и собак, имели схожие морфологические характеристики и представляли собой два типа клеток: мелкие округлые клетки и более крупные узкие веретенообразные с фибробластоподобной морфологией. Обе популяции проявляли способность к сильной адгезии к культуральному пластику и высокую клонообразующую способность (88,3±0,10 % у ММСК кошек и 88±0,15 % у ММСК собак). Время одной цитогенерации у ММСК кошек составило 34,6±0,02 ч, у собак 50,0±0,01 ч. Митотический индекс ММСК ЖТ кошки и ММСК ЖТ собаки — соответственно 3,4 и 2,7 ‰. Способность ММСК кошки и собаки к индукционной остео-, хондро- и адипогенной дифференцировке in vitro изучали с использованием наборов StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit, StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit и StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit («Gibco», США). Адипогенная дифференцировка сопровождалась появлением клеток округлой формы с липидными везикулами в цитоплазме, которые выявлялись при окрашивании жировым красным O. Окрашивание ММСК ЖТ кошки и собаки на специфическую активность эндогенной щелочной фосфатазы оказалось положительным на 14-е сут культивирования в индукционной среде. Окрашивание ММСК ЖТ серебрением по von Kossa выявило в клетках секрецию внеклеточного матрикса в виде фосфатов и карбонатов на 21-е сут после индукции. После культивирования клеток, выделенных из ЖТ кошек и собак, в хондрогенной среде в течение 21 сут было обнаружено формирование круглых структур, которые окрашивались альциановым синим, с визуализируемыми изогенными группами, схожими с лакунами гиалинового хряща. Таким образом, было показано, что клетки, выделенные из ЖТ кошек и собак, проявляют в культуре свойства ММСК. Полученные культуры клеток были размножены и депонированы в Специализированную Коллекцию перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН).
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимные стволовые клетки, жировая ткань, культивирование, индукция, дифференцировка in vitro, кошка, собака.
CHARACTERIZATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS ISOLATED FROM FELINE AND CANINE ADIPOSE TISSUE
I.P. Savchenkova, S.A. Vasilyeva, D.G. Korovina, А.А. Shabeikin, A.M. Gulyukin
Multipotent mesenchymal stem cells (MMSCs) are a promising tool of regenerative medicine for treatment of various small animal diseases. MMSCs have a high proliferative activity, multipotent properties, low immunogenicity, as well as the ability to migrate to the damaged tissue and promote its healing and regeneration. Currently, the methods of regenerative medicine are actively developing to solve problems that are difficult to cope with alternative treatments. However, data on the use of these cells in the clinic are ahead of the study of the properties of these cells in culture. This paper is our first report on isolation cells with phenotype similar to mammalian multipotent mesenchymal stem cells from feline and canine adipose tissue. The aim of the presented research was to study the cells properties with a phenotype similar to MMSC isolated from feline and canine adipose tissue (AT) in vitro. Isolation of cells was achieved by mechanical and enzymatic treatments of the AT. For enzymatic dissociation, the tissues were treated with a 0.01 % collagenase type II solution based on DMEM-LG (PanEco, Russia) with low glucose (1 g/l) at 37 °С for 60 min. The comparative analysis of properties of the derived cellular populations is carried out. Cells isolated from feline and canine adipose tissue had similar morphological characteristics and were represented by two cellular types: small round cells and larger narrow spindle like fibroblast. They had a strong adhesion to cultural plastic and high colonies formation ability, 88.3±0.10 % for feline MMSCs and 88.0±0.15 % for canine MMSCs. The generation time of feline MMSCs was 34.6±0.02 h, while in canine MMSCs it was 50.0±0.01 h. Mitotic index of feline and canine MMSCs was 3.4 ‰ and 2.7 ‰, respectively. The ability of the MMSCs to induced osteo-, chondro- and adipogenic differentiation in vitro was demonstrated using StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit, StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit и StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco, USA), respectively. Adipogenic differentiation accompanied by the appearance of rounded cells with lipid vesicles in the cytoplasm that were identified with the specific dye Oil red O. Specific staining of feline and canine MMSCs for endogenous alkaline phosphatase was positive on day 14 of culture in the induction medium. MMSCs stained by von Kossa revealed extracellular matrix formation on day 21 after induction. Alcian blue staining of cells cultured in chondrogenic medium for 21 days visualized formation of round structures with isogenic groups similar to the lacunae of hyaline cartilage. Thus, it was shown that cells isolated from feline and canine adipose tissue exhibit in culture the properties of MMSC. The derived cell cultures were propagated and deposited to Kovalenko VIEV Specialized Collection of somatic cell cultures of farm and commercial animals.
Keywords: multipotent mesenchymal stem cells, adipose tissue, culture, induced differentiationin vitro, feline, canine.
ФГБНУ ФНЦ Всероссийский НИИ экспериментальной |
Поступила в редакцию |