doi: 10.15389/agrobiology.2019.2.378rus
УДК 636.2:619:57.083:577.2
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium,
Mycoplasma californicum И ВЫЯВЛЕНИЕ Ureaplasma diversum
МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
А.Д. КОЗЛОВА, Н.С. ГОРБАЧЕВА, Р.Ф. ХАЕРОВА, М.С. КРАСНИКОВА,
Е.А. ЛАЗАРЕВА, С.П. ЯЦЕНТЮК
Микоплазмы и уреаплазмы — важные этиологические агенты маститов, пневмоний и репродуктивных нарушений у крупного рогатого скота (КРС), которые наносят значительный экономический ущерб хозяйствам. К наиболее распространенным клинически значимым видам относятся Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium, M. californicum и Ureaplasma diversum. Существующие диагностические наборы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяют с высокой точностью выявлять в биологическом материале бактерии рода Mycoplasma, но не проводить видовую идентификацию. В представленной работе с помощью разработанных методик на основе ПЦР мы впервые выявили и дифференцировали патогенные виды семейства Mycoplasma taceae в образцах криоконсервированной спермы быков-производителей, используемой для искусственного осеменения в отечественных хозяйствах. Нашей целью была разработка методик для идентификации и дифференциации наиболее распространенных патогенных микоплазм (Mycoplasma bovis, M. californicum, M. bovigenitalium) и Ureaplasma diversum на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. В качестве мишеней для ПЦР были выбраны гены UvrC для M. bovis, 16S рРНК для M. bovigenitalium и U. diversum, ген rpoB для M. californicum. В методики включили систему праймеров и зондов для детекции амплификации экзогенного неконкурентного внутреннего контрольного образца (ВКО). Специфичность разработанных методик проверяли на панели образцов, содержащей вирусные и бактериальные патогены, которые вызывают заболевания у крупного рогатого скота, а также геномную ДНК коровы. Для оценки чувствительности каждой методики были разработаны положительные контрольные образцы на основе генно-инженерных конструкций, содержащих участок соответствующей специфической ДНК. Аналитическую чувствительность оценивали отдельно для каждого патогена, для чего исследовали 10-кратные разведения соответствующих контрольных образцов в отрицательных пробах биологического материала (сперма, молоко, влагалищные смывы, внутренние органы). Для разных видов материала аналитическая чувствительность составила в среднем 5×103 копий/мл. Эффективность амплификации для M. bovis составила 99 %, для M. bovigenitalium — 87 %, для M. californicum — 94 %, для U. diversum — 98 %. С помощью разработанных методик были исследованы 410 образцов спермы быков для искусственного осеменения из отечественных и зарубежных племенных центров. ДНК M. bovis была обнаружена в 2,5 % образцов из зарубежных племенных центров. В образцах спермы из отечественных хозяйств ДНК M. bovis не выявили. Положительный результат обнаружения ДНК M. bovigenitalium был получен для 60,7 % отечественных и для 25,1 % импортных образцов спермы, ДНК M. californicum обнаружили соответственно в 51,7 % и 25,1 % образцов. ДНК Ureaplasma diversum — в 55 % образцов спермы быков из российских племенных центров и в 12,1 % образцов спермы иностранного происхождения. Коинфицирование M. californicum/M. bovigenitalium выявили в 97 образцах (23,7 %), M. bovigenitalium/U. diversum — в 86 случаях (21 %). Одновременное инфицирование M. bovigenitalium, M. californicum и U. diversum отмечали в 52 образцах (24,6 %) спермы из отечественных хозяйств и в 4 образцах (2,0 %) из зарубежных племенных центров. Разработанные методики могут использоваться в ветеринарных лабораториях для совершенствования диагностики и оптимизации противоэпизоотических мероприятий, а также для мониторинга качества спермы КРС, используемой для искусственного осеменения.
Ключевые слова: Mycoplasma bovis, Mycoplasma californicum, Mycoplasma bovigenitalium, Ureaplasma diversum, ПЦР в реальном времени, быки, сперма.
A.D. Kozlova, N.S. Gorbacheva, R.F. Hayerova, M.S. Krasnikova, E.A. Lazareva, S.P. Yatsentyuk
Mycoplasmas and ureaplasmas are important etiological agents of mastitis, pneumonia and reproductive disorders in cattle, which cause significant economic damage to cattle farming. The most significant species are Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium, M. californicum and Ureaplasma diversum. Commercial diagnostic PCR systems for the detection of bacteria of the genus Mycoplasma in different biological samples are described, but no PCR kits have been developed to address the identification of Mycoplasma species. In this work, real time PCR assays for differentiation of pathogenic mycoplasmas (Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium, M. californicum) and detection of Urea-plasma diversum in biological material (semen, milk, vaginal swabs, tissues) are developed. UvrC gene for M. bovis, 16S rRNA gene for M. bovigenitalium and U. diversum, and rpoB gene for M. californicum were chosen as target genes. The PCR assays included a system of primers and probes for detection of exogenous noncompetitive internal control sample. The specificity of the developed techniques was tested on a panel of samples containing viral and bacterial pathogens causing diseases in cattle, as well as cow genomic DNA. To assess the sensitivity of each PCR assay, positive control samples were developed based on genetically engineered constructs containing the region of the corresponding specific DNA. Analytical sensitivity of the PCR assays was evaluated separately for each pathogen, for which we used 10-fold dilutions of the corresponding control samples in negative samples of biological material, i.e. semen, milk, vaginal swabs and tissues. The sensitivity (detection limit) of the assays for different types of biological species was 5×103 copies per ml on average. The efficiency of PCR was 99 % for M. bovis, 87 % for M. bovigenitalium, 94 % for M. californicum, and 98 % for U. diversum. A total of 410 samples of bovine semen intended for artificial insemination from local and foreign breeding centers were tested to detect M. californicum, M. bovigenitalium, M. bovis and U. diversum. DNA of M. bovis was found in 2.5 % of semen samples from foreign centers. In samples of Russian origin M. bovis DNA was not detected. DNA of M. bovigenitalium was identified for 60.7 % of local and 25.1 % of foreign semen samples; DNA of M. californicum was detected in 51.7 % and 25.1 % samples, respectively. Ureaplasma diversum DNA was found in 55.0 % of semen samples from Russian bulls and in 12.1 % of semen samples of foreign origin. Co-infection of M. californicum/M. bovigenitalium was detected in 97 samples (23.7 %), M. bovigenitalium/U. diversum in 86 cases (21.0 %). Simultaneous infection of M. bovigenitalium, M. californicum and U. diversum was observed in 52 samples (24.6 %) of semen from domestic bull sires and in 4 samples (2.0 %) from foreign breeding centers. Novel PCR assay tests can be used for monitoring of semen quality as well as control and prevention of the pathogens distribution.
Keywords: Mycoplasma bovis, Mycoplasma californicum, Mycoplasma bovigenitalium, Ureaplasma diversum, real-time PCR, bovine semen.
ФГБУ Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств |
Поступила в редакцию |
