doi: 10.15389/agrobiology.2019.2.369rus
УДК 619:578:57.083.2:577.2
Работа выполнена по государственному заданию № 007-01359-17-00 в рамках выполнения Федеральной научно-технической программы развития сельского хозяйства на 2017-2025 годы, подпрограмма «Создание отечественных конкурентоспособных мясных кроссов кур бройлерного типа».
МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ МУЛЬТИЛОКУСНАЯ ПЦР В РЕАЛЬНОМ
ВРЕМЕНИ ДЛЯ АНАЛИЗА И КОНТРОЛЯ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА ПТИЦ
ПОДГРУПП A, B, J и K В РОССИИ
А.М. БОРОДИН1,5, Я.И. АЛЕКСЕЕВ2,3, Н.В. КОНОВАЛОВА3,
Е.В. ТЕРЕНТЬЕВА3, Н.Ю. СЕРОВА4, Д.Н. ЕФИМОВ5, Ж.В. ЕМАНУЙЛОВА5, С.В. СМОЛОВ5, О.А. ОГНЕВА5, В.И. ФИСИНИН6
Вирус лейкоза птиц (ВЛП) относится к роду Alpharetrovirus семейства Retroviridae иимеет диплоидный геном, состоящий из одноцепочечной РНК. Для кур специфичны вирусы подгрупп A, B, C, D, E, J и K. Классификация вируса основана на различиях в структуре белка оболочки — GP85. Инфекция ВЛП, и в особенности инфекция ВЛП подгруппы J, наносит огромный ущерб промышленному птицеводству. Золотым стандартом для выявления ВЛП считается выделение вируса в культурах клеток CEFs или DF-1. Недостаток этого метода — длительность процедуры до получения результата (7-9 сут). Наиболее широкое распространение для выявления ВЛП получил иммуноферментный анализ. В его основе лежит выявление группоспецифического антигена ВЛП р27.Однако у этого метода также есть недостатки, главные из которых — получение ложноположительных результатов из-за экспрессии р27 эндогенными вирусами и недостаточная чувствительность. При проведении настоящего исследования нами разработана тест-система для выявления наиболее распространенных в мире подгрупп ВЛП (A, B, J и K) и осуществления контроля за распространением ВЛП. Испытание тест-системы проводили на 1200 образцах ДНК бройлеров одного из птицеводческих хозяйств Московской области. Анализ образцов показал наличие ВЛП подгруппы J у 51 % поголовья, ВЛП подгруппы К — у 8 %. При этом ВЛП подгрупп А и В в проанализированной выборке не обнаружили. Также были проанализированы 97 проб ДНК от кур из регионов России — Оренбургской, Челябинской, Кемеровской, Тюменской, Калининградской, Ленинградской, Свердловской, Новгородской областей и Краснодарского края. ВЛП подгруппы К обнаружен в образцах из Калининградской, Ленинградской, Свердловской, Новгородской областей, ВЛП подгруппы А — в образцах из Ленинградской области, ВЛП подгруппы J — в Свердловской и Ленинградской областях. ВЛП подгруппы В не выявили. Это может говорить о том, что эта подгруппа ВЛП не распространена в России в настоящее время. На следующем этапе были предприняты мероприятия по эрадикации ВЛП подгрупп J и К, обнаруженных у исходных линий мясного кросса бройлерного типа в одном из хозяйств Московской области. Для этого была разработана и применена мультиплексная мультилокусная ПЦР-РВ тест-система для одновременного выявления ВЛП подгрупп J и К. С использованием предложенной тест-системы проведено несколько циклов скрининга четырех исходных линий мясного кросса кур бройлерного типа с исходной общей численностью 9029 цыплят. До начала программы эрадикации ВЛП доля птицы с неоплазиями составляла от 17 до 26 % в зависимости от линии кур (максимум наблюдался у линии с локусом ev21).На 265-е сут после начала реализации программы эрадикации ВЛП подгрупп J и K было зафиксировано выбытие всего трех из 2621 особей (0,10 %) с диагнозом неоплазия, подтвержденным положительным результатом ПЦР-РВ как ВЛП подгруппы J. Всего доля особей, содержащих ДНК ВЛП подгрупп J и К, в выборке из 2621 особи в возрасте 265 сут составила соответственно 0,67 % и 0,04 %.
Ключевые слова: вирус лейкоза птиц, ВЛП подгрупп A, B, J, К, полимеразная цепная реакция в реальном времени, выявление ВЛП.
А.М. Borodin1, 5, Ya.I. Alekseev2, 3, N.V. Konovalova3, Е.V. Terentyeva3, N.Yu. Serova4, D.N. Efimov5, Zh.V. Emanuilova5, S.V. Smolov5, О.А. Ogneva5, V.I. Fisinin6
The avian leukosis virus (ALV) belongs to genus Alpharetrovirus of Retroviridae family and has a diploid genome consisting of a single-stranded RNA. ALV subgroups A, B, C, D, E, J and K are specific for chicken. The classification is based on differences in the viral coat protein structure. ALV, in particular ALV subgroup J, causes huge damage to industrial poultry. The gold standard for detecting ALV is virus isolation in CEFs or DF-1 cell cultures. This method has significant disadvantages, i.e. it takes 7-9 days, requires specialized facilities and equipment. Enzyme-linked immunosorbent assay based on detection of the ALV p27 group-specific antigen is the most widely used, but it also has significant deficiencies, the main of which are false positive results due to the expression of p27 by endogenous viruses and lack of sensitivity. In this study, a test system has been developed to detect exogenous viruses of the most common ALV subgroups A, B, J, and K and to control the spread of ALV. To test the developed system, we use 1200 samples of broiler DNA from a poultry farm of the Moscow Province. Analysis of the samples detected ALV subgroup J in 51 % poultry flock and ALV subgroup K in 8 % poultry flock. No viruses of subgroups A and B were found. We also analyzed 97 DNA samples from chickens from the regions of Russia, i.e. Orenburg, Chelyabinsk, Kemerovo, Tyumen, Kaliningrad, Leningrad, Sverdlovsk, Novgorod regions and Krasnodar Territory. ALV subgroups K were found in samples from the Kaliningrad, Leningrad, Sverdlovsk, and Novgorod regions, ALV subgroups A in samples from the Leningrad region, and ALV subgroups J in the Sverdlovsk and Leningrad regions. ALV subgroup B has not been identified, that is, it may indicate that this subgroup of ALV is not common in Russia at the present time. At the next stage, measures were taken to eradicate the ALV of subgroups J and K found in the broiler-type meat cross lines in one of the farms of the Moscow Province. For this, a multiplex multilocus real-time PCR test system was developed and applied for the simultaneous detection of ALV subgroups J and K. Using the proposed test system, several screening cycles of four broiler-type chicken meat cross lines with an initial total of 9029 chickens were performed. Prior to the start of the program for control and eradication of ALV, the proportion of poultry with neoplasia ranged from 17 to 26 % depending on the line of chickens (the maximum was observed in the line with the ev21 locus). On the 265th day after the start of the program for the control and eradication of ALV subgroups J and K, only three out of 2621 individuals (0.10 %) were diagnosed with a diagnosis of neoplasia, confirmed by positive results of real-time PCR as ALV subgroup J. Total percentage of individuals’ samples containing ALV DNA of subgroups J and K in a sample of 2621 individuals at the age of 265 days were 0.67 % and 0.04 %, respectively.
Keywords: Avian leukosis virus, ALV subgroups A, B, J and K, real time PCR, ALV detection.
1НП Институт медико-биологических исследований, |
Поступила в редакцию |
