doi: 10.15389/agrobiology.2018.2.422rus
УДК 636.2:619:57.083.2:577.2
РАЗРАБОТКА ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЗАРАЗНОГО
УЗЕЛКОВОГО ДЕРМАТИТА В ПРОБАХ ОТ КРУПНОГО РОГАТОГО
СКОТА
Я.Е. ПЕСТОВА, Е.Е. АРТЮХОВА, Е.Е. КОСТРОВА, И.Н. ШУМИЛОВА, А.В. КОНОНОВ, А.В. СПРЫГИН
Заразный узелковый дерматит (нодулярный дерматит, НД, бугорчатка, nodular dermatitis, lumpy skin disease, LSD) представляет серьезную угрозу скотоводству, в связи с чем необходимы надежные экспресс-методы для лабораторной диагностики заболевания на фоне применения живых гомологичных вакцин. Ранее предложенные и рекомендованные World Organization for Animal Health (Международное эпизоотическое бюро, Париж, OIE — МЭБ) методы выявляют также ДНК вирусов оспы овец и оспы коз. В классической ПЦР существует риск контаминации продуктами амплификации в связи с необходимостью электрофоретической детекции. C.E. Lamien с соавт. (2011) разработали метод детекции вируса заразного узелкового дерматита, вируса оспы коз и вируса оспы овец амплификацией фрагментов ДНК с последующим анализом их кривых плавления с высоким разрешением. Однако высокая зависимость метода от качества и концентрации ДНК в исследуемой пробе не позволяет использовать его в рутинной диагностике. Нами представлены результаты разработки, применения и оптимизации метода ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для выявления ДНК полевых изолятоввируса LSDв образцах биоматериала от крупного рогатого скота. Специфичность метода оценили с использованием ДНК гомологичных и гетерологичных вирусов, депонированных в коллекции микроорганизмов ФГБУ ВНИИЗЖ. Разработанный метод продемонстрировал высокую специфичность в отношении полевых изолятов вируса заразного узелкового дерматита. Ложноположительных результатов с аттенуированным вакцинным штаммом и родственными каприпоксвирусами не выявлены. Чувствительность метода, которую оценивали, используя 10-кратные разведения ДНК референтного штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 (диагностический), составила 0,21 lg ТЦД50/мл. Показана эффективность амплификации 98,6 % с вариабельностью стандартного отклонения (±SD) при тестировании пяти 10-кратных разведений в 3-кратной повторности от 0,11 до 0,33. Валидацию метода проводили с образцами от экспериментально зараженных животных. Быков заражали подкожно, отбирали пробы цельной крови и носовых смывов. Дополнительно образцы анализировали методом классической ПЦР по D.C. Ireland и Y.S. Binepal (1998) (данные не приведены). При тестировании предложенная нами тест-система ПЦР-РВ для выявления ДНК полевых изолятов вируса заразного узелкового дерматита показала высокую специфичность и чувствительность и может быть рекомендован для анализа полевых образцов в профильных ветеринарных лабораториях.
Ключевые слова: заразный узелковый дерматит, lumpy skin disease, LSD, диагностика, ПЦР-РВ, геном, вирус.
Ya.E. Pestova, E.E. Artyukhova, E.E. Kostrova, I.N. Shumoliva, A.V. Kononov, A.V. Sprygin
Lumpy skin disease caused by lumpy skin disease virus (LSDV, Capripoxvirus, Poxviridae) is a capripoxviral disease with significant morbidity in cattle, which necessitates the development of reliable diagnostic tools in the context of live vaccine administration. OIE-recommended PCR assays target not only LSDV but also sheep pox virus and goat pox virus. Conventional PCR is prone to carry-over contamination, whereas real-time PCR offers more advantages, including prevention of amplicon carryover contamination post amplification. In this paper we report the development of a PCR real time assay for the detection of field isolates of lumpy skin disease virus in clinical samples from cattle. The specificity was validated against a panel of homologous and heterologous viruses retrieved from the strain depository of FGBI ARRIAH. The PCR assay was shown to be highly specific toward field LSDV. When tested in the presence of vaccine strain DNA and related capripoxviruses, no false-positive results were obtained. Using a series of 10-fold dilutions the assay proved to be highly sensitive with a detection limit of 0.21 lg TCD50/ml. The calculated efficiency of amplification was 98.6 %, with SD ranging from 0.11 to 0.33 over five orders of magnitude. The PCR assay was also validated on samples from experimentally inoculated bulls. The animals received a subcutaneous injection of a field LSDV and were tested for the presence of LSDV DNA in blood and nasal swab in comparison to PCR by D.C. Ireland и Y.S. Binepal (1998) (data not shown). Overall, the presented assay demonstrated high specificity and sensitivity and can be recommended as a diagnostic tool for the detection of field isolated of LSDV.
Keywords: lumpy skin disease, diagnostics, real-time PCR, genome, virus.
ФБГУ Федеральный центр охраны |
Поступила в редакцию |
