doi: 10.15389/agrobiology.2017.2.298rus
УДК 636.2+636.1]:636.082:591.463.1:576.08:547.78
СВЕРХМАЛЫЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА
ПОВЫШАЮТ УСТОЙЧИВОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ БЫКОВ И
ЖЕРЕБЦОВ ПРИ КРИОКОНСЕРВАЦИИ И ДЕЙСТВИИ ВРЕДНЫХ
ФАКТОРОВ
Е.В. НИКИТКИНА1, И.Ш. ШАПИЕВ1, К.В. ПЛЕМЯШОВ1, С.А. ХАРИТОНОВ2
Один из подходов к решению практических проблем криоконсервации клеток заключается в повышении устойчивости сперматозоидов к повреждающему действию низких температур. Мы изучили влияние производных бензимидазола этил-1-бензимидазол-2-ил-сульфанила, 2-этилсуль-фанилбензимидазол-1-ила и 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в концентрациях 10-3, 10-5, 10-11, 10-13, 10-15 М на сохранность сперматозоидов при замораживании и оттаивании, на их устойчивость к холодовому шоку и изменению осмотического давления. Установлено, что изученные вещества повышали живучесть бычьих сперматозоидов при хранении в лактозо-цит-ратной среде. При этом наибольшую активность и сохранность отмечали при введении в среду для замораживания спермы 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в сверхнизкой концентрации 10-13-10-15 М. Время переживания сперматозоидов до сохранения подвижности у 10 % клеток повышалось по сравнению с контролем на 73 %. Аналогичные результаты получили при замораживании-оттаивании спермы жеребцов в присутствии 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в концентрации 10-13 М: доля подвижных неповрежденных клеток после замораживания-оттаи-вания оказалась на 15,2±3,49 млн/мл (Р < 0,01) больше, чем в среде без добавки. Выживаемость сперматозоидов быков после замораживания-оттаивания была на 8,1 % (Р < 0,01) выше, чем в контроле, сохранность акросом — на 1,9±0,63 % (Р < 0,05) выше. При изменении осмолярности среды для разбавления спермы и после холодового шока 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусная кислота увеличивала живучесть сперматозоидов быка при повышенной температуре (40 °С). Можно предположить, что наблюдаемый эффект связан с защитным действием 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты на плазматическую мембрану и мембранные структуры митохондрий сперматозоидов. Действительно, динитрофенол практически одинаково усиливал клеточное дыхание в опыте и контроле, тогда как сукцинат, который проникает через поврежденные мембраны, оказывал меньшее стимулирующее влияние в присутствии 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты. В результате проведенных исследований предложена гипотеза о механизме действия сверхмалых концентраций производных бензимидазола на криорезистентность половых клеток при замораживании. Молекулы исследуемого вещества взаимодействуют с рецептором на внешней мембране сперматозоида, что взывает перестройку мембранных структур клетки. Одновременно происходит изменение вязкости воды, ассоциированной с белками мембраны, из-за формирования водородных связей с кислотными остатками в молекуле производного бензимидазола. В результате повышается устойчивость мембранных структур сперматозоидов к повреждениям вследствие колебаний осмотического давления. Такое состояние воды, возможно, сказывается на характере кристаллообразования при замерзании в сторону уменьшения размеров кристаллов, что снижает их повреждающее действие.
Ключевые слова: сперма, замораживание, бензимидазол, сверхмалыe концентрации, мембраны клеток, митохондрии, быки, жеребцы.
E.V. Nikitkina1, I.Sh. Shapiev1, K.V. Plemyashov1, S.A. Kharitonov2
One of the possible ways to improve sperm cryopreservation is to find how to increase the resistance to damaging effects of low temperatures. Here we summarize our findings on the bull and stallion semen cryoresistance as influenced by ultra-low concentrations of biologically active substances, the ethyl-1-benzimidazol-2-yl-sulfanyl, 2-ethylsulfanyl-benzimidazol-1-yl and 2-benzimidazol-1-yl-acetic acid. It was found that these substances increased survivability of bull semen during storage in lactose-citrate semen extender. The best motility and vitality of sperm after freezing and thawing was observed when sperm was diluted by extender with added 2-benzimidazol-1-yl-acetic acid in the ultra-low concentrations of 10-13 to 10-15 M. The viability of sperm to 10 % motility was 73 % higher as compared to control. Similarly, freezing equine sperm in extender supplemented with 2-benzoimidazol-1-yl-acetic acid at 10-13 M was more effective: the semen survival after freezing and thawing was 8.1 % (P < 0.01) higher than that in the control, and the intactness of acrosome was 1.9±0.63 % higher (P < 0.05). 2-Benzimidazol-1-yl-acetic acids also improved semen vitality at 40 °С when different osmolarity and after cold shock. It can be assumed that the observed phenomenon is likely due to the protective effect of 2-benzimidazole-1-yl-1-acetic acid to plasma membrane and the mitochondria membrane structure of spermatozoa. Study of respiration in bovine sperm after freezing and thawing confirmed this assumption. Indeed, dinitrophenol almost equally increased cell respiration despite the presence or absence of 2-benzimidazole-1-yl-1-acetic acid in the semen extender while succinate, which penetrates through the damaged membranes, had less stimulating effect when 2-benzimidazole-1-yl-1-acetic acid added. The studies suggested the hypothesis that benzimidazole, a biologically active substance, at ultra-low concentrations can bind to a receptor on the sperm outer membrane resulting in the cell membrane restructuring. At the same time, the changes in viscosity of water associated with the membrane proteins may occur due to hydrogen bonds between water molecules and acid residues of benzimidazole molecules. As a result stability of the membrane structures to damaging effect of varying osmotic pressure increases. Possibly crystal formation of water associated with the cell membranes is decreasing during freezing that also reduces the damaging effect.
Keywords: sperm, freezing, benzimidazole, ultralow concentrations, cell membrane, mitochondria, bulls, stallions.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ генетики и разведения |
Поступила в редакцию |
