doi: 10.15389/agrobiology.2017.2.401rus
УДК 619:579.843.95:616-078
ВЫЯВЛЕНИЕ Pasteurella multocida И ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ПЯТИ ЕЕ
КАПСУЛЬНЫХ ГРУПП ПРИ ПОМОЩИ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ
РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
А.В. НЕФЕДЧЕНКО1, А.Н. ШИКОВ2, А.Г. ГЛОТОВ1, Т.И. ГЛОТОВА1,
В.А. ТЕРНОВОЙ2, Р.А. МАКСЮТОВ1, 2, А.П. АГАФОНОВ2, А.Н. СЕРГЕЕВ2
Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота причиняют значительный экономический ущерб животноводству. В этиологии этих болезней существенная роль принадлежит бактерии Pasteurella multocida, у которой выявлено 5 капсульных групп (A, B, D, E, F), имеющих разное эпизоотологическое значение. Идентификация бактерий, основанная на результатах изучения их культурально-морфологических и биохимических свойств, — трудоемкий и длительный процесс. Методы молекулярной биологии, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяют быстро обнаружить и идентифицировать микроорганизмы непосредственно в пробах биологического материала, смешанных или чистых культурах. Целью нашего исследования стала разработка и изучение эффективности мультиплексной ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени для выявления культур Pasteurella multocida и генотипирования пяти капсульных групп (A, B, D, E, F). В работе использовали референтные штаммы P. multocida (1231, 681 и Т80), культуры бактерий, выделенные от больных животных в 2013-2014 годах, а также 260 проб биоматериала (легкие, селезенка, средостенные и бронхиальные лимфатические узлы), отобранных от павших телят в возрасте от 4 сут до 6 мес с признаками респираторных болезней. Олигонуклеотидные праймеры и зонды были разработаны на высококонсервативный ген кmt1 и гены локуса капсульного синтеза (hyaD, fcbD, dcbF, bcbD и ecbJ), специфичные для капсульных групп. Для проверки чувствительности реакции использовали разработанные положительные контрольные образцы и суспензии культур референтных штаммов и изолятов. Специфичность реакции подтверждали секвенированием ампликонов. Чувствительность выявления ДНК бактерии для разных групп составила от 1,6x10 до 5,9x102 геномных эквивалентов на реакцию, неспецифических реакций не наблюдали. Диагностическая чувствительность разработанного метода составила при исследовании чистых культур 103 КОЕ/мл, при исследовании биологического материала — 105 КОЕ/г. Методом ПЦР типировали 11 культур бактерий, ранее охарактеризованных серологически и бактериологически, относящихся к капсульным группам А, В и D. Анализ последовательности гена kmt1 подтвердил результаты ПЦР. При исследовании 260 проб биоматериала от больных животных обнаружили Pasteurella multocida в 63,3 % проб легких, 42,6 % — лимфатических узлов, 8,8 % — селезенки. Не установлена циркуляция среди восприимчивого поголовья животных бактерии Pasteurella multocida генотипов В и Е. В большинстве исследованных проб были выявлены генотипы А, реже — D, в одном случае — F.
Ключевые слова: Pasteurella multocida, полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, гены, капсульные группы.
A.V. Nefedchenko1, A.N. Shikov 2, A.G. Glotov1, T.I. Glotova1,
V.А. Ternovoy 2,
R.A. Maksyutov1, 2, A.P. Agafonov 2, A.N. Sergeev 2
Respiratory diseases in calves cause significant economic losses in livestock. Bacterium Pasteurella multocida plays important role in the etiology of these diseases. It is known that five identified P. multocida capsular groups (A, B, D, E and F) differently affect animal epizooty. Identification of bacteria based on the cultural, morphological, biochemical properties is very labor-intensive and time-consuming. Molecular biology techniques, in particular, the polymerase chain reaction (PCR), quickly detect and identify microorganisms directly in samples of biological material, mixed or pure cultures. In this regard, the purpose of our research was to develop multiplex real-time PCR for the detection, genotyping and discrimination of five P. multocida capsular groups (A, B, D, E and F) in cattle. The target primers and probes to the highly conserved gene kmt1 and the genes in the loci of capsule synthesis (hyaD, fcbD, dcbF, bcbD and ecbJ) specific to the capsular groups have been designed. The sensitivity of DNA detection for different bacterial groups ranged from 1.6x10 to 5.9x102 genomic equivalents per reaction, non-specific reactions were not observed. The diagnostic sensitivity of the test was 103 CFU/ml for pure cultures and 105 CFU/g for biological material. The developed PCR protocol allowed us to type 11 bacterial cultures which were previously characterized serologically and bacteriologically and related to capsular groups A, B, and D. The kmt1 gene sequencing confirmed the results of PCR analysis. PCR analysis of 260 samples from died calves detected P. multocida in lung (63.3 %), the lymph nodes (42.6 %), and spleen (8.8 %). We did not revealed the circulation of P. multocida В and E capsular groups among the tested livestock, the majority of the samples contained P. multocida group A, in some cases, there was group D, and, in one case, group F.
Keywords: bacteria, Pasteurella multocida, real-time PCR, genes, capsular groups.
1ФГБУН Сибирский ФНЦ агробиотехнологий РАН, |
Поступила в редакцию |
