doi: 10.15389/agrobiology.2017.2.367rus
УДК 636.52/.58:636.082.2:577.21
При проведении исследования использовано научное оборудование центра коллективного пользования «Биотехнология» Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии. Работа выполнена при финансовой поддержке ФАНО России, дополнительное государственное задание ФГБУ СГЦ Смена на IV квартал 2016 года № 007 от 5 августа 2016 года, в рамках выполнения Федеральной научно-тех-нической программы развития сельского хозяйства на 2017-2025 годы (Подпрограмма 2 «Создание отечественного конкурентоспособного кросса мясной птицы»).
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТИПИРОВАНИЕ ГЕНОВ,
КОНТРОЛИРУЮЩИХ СКОРОСТЬ ОПЕРЕНИЯ КРЫЛА У КУР
(Gallus gallus L.), В СВЯЗИ С РАЗДЕЛЕНИЕМ ПО ПОЛУ
Я.И. АЛЕКСЕЕВ1, 2, А.М. БОРОДИН3, А.В. НИКУЛИН1,
Ж.В. ЕМАНУЙЛОВА4,
Д.Н. ЕФИМОВ4, В.И. ФИСИНИН5
Традиционная селекция животных длительна по времени и требует больших материальных затрат. Применение лабораторных молекулярно-генетических методов значительно ускоряет и удешевляет процесс создания пород и кроссов с нужными свойствами, отбор желательных генотипов. Молекулярное типирование по аллелям, сцепленным с полом, важно для получения исходных линий птицы, дающих аутосексное потомство. Разделение по полу при выращивании бройлеров — известный технологический прием, который обеспечивает более эффективное использование корма, лучшую выживаемость, сортность, повышенное сходство по массе. Нами разработан тест, позволяющий, используя технологию количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), различать у 1-суточных цыплят гомо- и гетерозиготное состояние сцепленных с полом аллелей К и k, отвечающих за скорость роста перьев крыла. Применение количественной ПЦР-РВ для анализа генотипов сводится к дискриминации содержания одной копии гена в геноме от двух. Для получения надежных результатов при проведении анализа необходимо придерживаться определенных правил: во-первых, эффективность ПЦР должна приближаться к максимуму, во-вторых, без надлежащей статистической обработки данных возможно получение ложных результатов. Для преодоления ограничений количественной ПЦР-РВ предложен новый алгоритм тестирования: все пробы подвергаются двум последовательным независимым анализам одновременно с референсными образцами (известные генотипы), а с пробами, давшими противоположные результаты, проводится повторный анализ без учета предыдущих данных. Такой подход исключает возможные ошибки. Предложена новая система из трех (вместо четырех) праймеров для амплификации двух генов и зонда, позволяющая эффективно дискриминировать генотипы КК, Кk и kk. Данные количественной ПЦР-РВ анализировали по методу ΔΔCt и обрабатывали при помощи пакета программ статистики SPSS с применением ROC-анализа. Использовав разработанный тест, мы определили процентное соотношение генотипов КК, Кk и kk среди 145 петухов исходных линий Б5, Б6, Б7 и Б9 отечественного мясного кросса Смена 8. Показано, что все протестированные 19 петухов линии Б5 и все 15 петухов линии Б6 имели генотип kk. Из 46 петухов линии Б7 ни у одного не обнаружили генотип kk, у 17 особей (37 %) выявили генотип Кk, у 29 особей (63 %) — генотип КК. Из 65 петухов линии Б9 ни один не был гомозиготным по аллелю k (генотип kk), 17 особей (26 %) оказались гетерозиготами с генотипом Кk и 48 особей (74 %) имели генотип КК. Для исключения влияния возможной вариабельности нуклеотидных последовательностей ДНК на результаты анализа провели секвенирование и установили отсутствие каких-либо нуклеотидных замен в участках отжига праймеров и зондов. Полученные результаты определения пола у 1-суточных цыплят с помощью количественной ПЦР-РВ (на основании выявления аллелей К и k, отвечающих за скорость роста перьев крыла) позволяют ускорить селекцию кур с целью создания нового отечественного мясного кросса. Дальнейшая селекционная работа предполагает оценку птицы традиционными и молекулярно-генетическими методами.
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция в реальном времени, qPCR, генотип, копийность генов, аутосексные куры, селекция птицы, мясной кросс.
Ya.I. Alekseev1, 2, А.М. Borodin3, А.V. Nikulin1, Zh.V. Emanuilova4,
D.N. Efimov4,
V.I. Fisinin5
Traditional breeding is time and material consuming. Modern laboratory techniques significantly speed up and reduce the costs for breeding animals with the desired properties. A test based on the quantitative real-time PCR (qPCR) technology was developed to distinguish between homozygous and heterozygous state of the genes from alleles K and k which are responsible for the rate of wing feather growth in day-old chicks. The use of quantitative real-time PCR for the analysis of genotypes is aimed at the discrimination between one and two copies of the target gene in a genome. To obtain reliable results, certain rules must be followed when conducting the assay: the efficiency of the PCR should be close to the maximum; it is possible to obtain a significant number of false results without the appropriate statistical analysis. A new assay algorithm was proposed to overcome the limitations of qPCR: all samples are subjected to two successive independent analyses in parallel with the reference samples of both genotypes; if the two runs produce divergent results then the assay is repeated and the previous results are discarded. This approach allows to reduce assay error probability down to zero. The new system consists of three (instead of four) primers for amplification of two genes and two probes, allowing efficient analysis of various allele K genotypes. Quantitative real-time PCR data analysis was performed by ΔΔCt method using the statistics software package SPSS for ROC analysis. Using the method developed, the percentage of KK, Kk and kk genotypes was determined in 145 cocks of original lines B5, B6, B7 and B9 of domestic meat chicken of cross Smena 8. It was shown that 19 cocks of line B5 and 15 cocks of line B6 had kk genotype. From the 46 cocks of line B7, none had kk genotype, 17 cocks (37 %) had Kk genotype, and 29 cocks (63 %) had KK genotype. From the 65 cocks of line B9, none had kk genotype, 17 cocks (26 %) had Kk genotype, and 48 cocks (74 %) had KK genotype. Analyzed fragments were sequenced to exclude the effects of possible nucleotide sequence variability on the assay. The sequences did not contain any nucleotide substitutions in the sites of the primers and probes annealing. The data obtained will accelerate selection of new domestic meat chicken breeds with possibility of sexing based on feather length in day-old chicken. Further breeding work involves the assessment of the offspring using traditional and molecular genetic methods.
Keywords: real-time polymerase chain reaction, qPCR, genotype, gene copy number, autosex chickens, poultry selection, meat chickens.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной |
Поступила в редакцию |
