УДК 636.087.7:577.15:57.088
doi: 10.15389/agrobiology.2016.2.223rus
ВИСКОЗИМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНДОГЛЮКАНАЗНОЙ
АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТНЫХ КОРМОВЫХ ДОБАВОК
А.A. КОМАРОВ, Л.Я. ТЕЛИШЕВСКАЯ, А.А. САРХАНОВА,
Л.В. ВАСИЛЬЕВА,
Е.Г. ТИТОВА, А.Н. ПАНИН
Многие зарубежные и российские компании производят большое число ферментных препаратов для кормопроизводства, в том числе имеющих эндо-β-глюканазную активность. Единых методов анализа активности этих препаратов нет, что создает трудности в оценке их качества. Целью предпринятого нами исследования была разработка унифицированной методики измерения. В результате впервые оптимизирована методика вискозиметрического определения действия фермента, основанная на оценке измерения относительной текучести субстрата с использованием капиллярного вискозиметра Оствальда. Приняты следующие условия проведения анализа: диаметр капилляра 0,73 мм; температура гидролиза 30 °С; растворитель — ацетатный буфер (рН 4,7), время анализа — 5, 10, 15 мин в соответствии с кинетикой ферментативной реакции; субстрат — β-глюкан в концентрации 0,4 %. Показано, что применение в качестве субстрата карбоксиметилцеллюлозы дает не сопоставимые с данными по β-глюкану результаты, которые характеризуют не β-глюканазную, а целлюлазную активность фермента, что не соответствует целям кормопроизводства. Единица измерения при использовании метода — количество фермента, которое в стандартных условиях гидролиза приводит к увеличению относительной текучести субстрата, равному 1 мин-1. Оценку показателей точности методики проводили по ГОСТ Р ИСО 5725-2002, для чего из коммерческого образца β-глюканазы («Sigma-Aldrich», США) с известной глюканазной активностью (стандарт) готовили 5 аттестованных образцов с разной активностью. За активность стандарта принимали величину, заявленную фирмой-производителем, с эквивалентом по глюкозе (соответствующую количеству фермента, которое действует на b-глюкан с высвобождением 1 мкмоль восстанавливающих сахаров в пересчете на глюкозу), приведенную к 1 г препарата (ед. ГлА). Анализ аттестованных образцов проводили в условиях внутрилабораторной прецизионности с тремя изменяющимися факторами: оператор, матрица, набор реактивов. В качестве матриц использовали минеральные наполнители — карбонат кальция и цеолит. Для оценки показателей точности методики результаты измерения вязкости аттестованных образцов пересчитывали по калибровочным кривым в единицах ГлА. Расширенная неопределенность результатов методики вискозиметрического определения эндо-β-глюканазной активности находится в пределах от 10 до 22 % при коэффициенте охвата k = 2.
Ключевые слова: эндоглюканазная активность, некрахмалистые полисахариды, гемицеллюлозы, вязкость, вискозиметрия, β-глюкан, карбоксиметилцеллюлоза, матрица, внутрилабораторная прецизионность, расширенная неопределенность.
VISCOSIMETRIC ASSAY OF ENDOGLUCANASE ACTIVITY IN ENZIME
FODDER ADDITIVES
A.A. Komarov, L.Ya. Telishevskaya, A.A. Sarkhanova, L.V. Vasil’eva,
E.G. Titova, A.N. Panin
Worldwide a large number of enzymes, including those with endo-β-glucanase activity are produced by different companies as fodder additives. In Russia, there is no uniform method for endo-β-glucanase activity analysis that causes difficulties in assessing quality of the enzyme preparations. The aim of the study was to develop such uniform method. In this, we optimized a viscometric determination based on change of the relative viscosity of a substrate mixed with enzyme preparation using Ostwald capillary viscometer. The following regime has been accepted: the diameter of the capillary is 0.73 mm; the temperature of hydrolysis is 30 °C; the solvent is the acetate buffer (pH 4.7); time of incubation is 5, 10, 15 min in accordance with the kinetics of the enzymatic reaction; and β-glucane (0.4 %) was used as substrate. The carboxymethyl cellulose is shown not to be relevant so far as it gives results incomparable with those obtained with β-glucane due to estimation of the cellulase but not the β-glucanase activity, that does not correspond to the objectives of forage production. The unit used in the developed method is the amount of enzyme which increases the relative substrate flow rate in 1 min-1 under standard conditions of hydrolysis. The measurement of accuracy of the method was carried out according to GOST R ISO 5725-2002 (the state standards). In this, 5 certified samples with different activity were prepared from a commercial sample of β-glucanase (Sigma-Aldrich, USA) with known activity (GLA/g). The activity of the standard was expressed in GLA/g as glucose equivalents corresponding to the amount of enzyme which acts on b-glucane, releasing 1 µmol of sugars in terms of glucose. Certified samples were analyzed under intermediate precision conditions with three factors changed (i.e., operator, matrix, reagents). The matrices were mineral fillers, the calcium carbonate and zeolite. To calculate the accuracy of the method the viscosity of certified samples was expressed in GLA units using the calibration curves. Expanded uncertainty of measurements ranged within 10-22 % for the coverage factor k = 2.
Keywords: endoglucanase activity, non-starch polysaccharides, hemicellulose, viscosity, viscosimetry, β-glucane, carboxymethyl cellulose, matrix, intermediate precision, expanded uncertainty.
ФГБУ Всероссийский государственный Центр |
Поступила |
Оформление электронного оттиска
