Сельскохозяйственная биология, 2011, № 2, с. 99-102.

УДК 636.2:619:578:57.083.224

ИНФЕКЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОГО ВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ

И.Я. СТРОГАНОВА¹, Л.М. АКБАЕВА²

Изучали чувствительность 27 культур клеток (органная, монослойные первично трипсинизированные и их субкультуры, диплоидные, перевиваемые линии) к штаммам РС-Б и РС-Р респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота. Наиболее чувствительными к штамму РС-Б оказались диплоидные культуры клеток легкого и почки эмбриона коровы, перевиваемые линии почки эмбрионов овцы и теленка, почки теленка и первично трипсинизированная культура клеток легкого эмбриона коровы. Штамм РС-Р проявил большую инфекционную активность, чем штамм РС-Б.

Ключевые слова: респираторно-синцитиальный вирус, крупный рогатый скот, культура клеток.

Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота (КРС) наносят огромный экономический ущерб животноводству (1). В хозяйствах мясомолочного направления они чаще протекают по типу энзоотической бронхопневмонии. Поскольку многие возбудители этих заболеваний убиквитарны, а у взрослых животных, как правило, уже выработан иммунитет, обычно респираторные заболевания возникают у телят в тот период, когда пассивный иммунитет снижается, а активный еще не сформирован (2-3). В числе таких возбудителей — вирус респираторно-синцитиаль-ной инфекции (РСИ), или РС-вирус (РНК-содержащий, относится к семейству парамиксовирусов, роду пневмовирусов — Paramyxoviridae, Pneumovirus). Классические клинические проявления болезни — поражение нижних отделов респираторного тракта, повышение температуры, затрудненное дыхание, выделения из носа, сильный кашель с последующим развитием бронхопневмонии и интерстициальных эмфизем (4-6). Вирус впервые был выделен в 1970 году от крупного рогатого скота с симптомами острого респираторного заболевания. В настоящее время РСИ КРС зарегистрирована в странах с развитым животноводством, с 1975 года — и в нашей стране (4-9).
По сравнению с другими вирусными респираторными инфекциями это заболевание менее изучено из-за чрезвычайной лабильности РС-вируса и его очень слабой способности к размножению в культурах клеток. Из-за сложности выделения и культивирования также затруднено получение достаточного количества вирусного материала с высокой инфекционной активностью, необходимого для изготовления диагностикумов и средств специфической профилактики. Отмечается, что не все клеточные культуры одинаково чувствительны к PC-вирусу КРС и степень чувствительности зависит от используемого вирусного штамма (10-16). Имеются сообщения о возможности накопления PC-вируса КРС в органных культурах клеток трахеи и легких плода КРС (10), в первично трипсинизированных культурах клеток легкого и тимуса эмбрионов КРС, тестикул бычка (11-12), в диплоидной культуре клеток щитовидной железы ягненка (14), в перевиваемых линиях клеток носовых раковин КРС, 12-перстной и прямой кишки теленка, НеLa, почки зеленой мартышки, почки эмбриона овцы, AUBEK (12, 15, 16).
Целью нашей работы было изучение чувствительности разных культур клеток к двум штаммам респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота.
Методика. Использовали штаммы РС-Б и РС-Р РС-вируса КРС и 27 типов культур клеток: органную — культуру клеток эксплантатов легкого эмбриона коровы (ЭЛЭК); монослойные первично трипсинизированные — культуры клеток почки, легких и тимуса эмбриона коровы (соответственно ПЭК, ЛЭК и ТЭК), тестикул бычков (ТБ) и их субкультуры; диплоидные — культуры клеток селезенки эмбриона коровы (С3Э), тимуса эмбриона коровы (Т3Э), почки эмбриона коровы (П3Э), легких эмбриона коровы (Л3Э и ДЛЭК); перевиваемые линии клеток — слизистой носа эмбриона коровы (FBN), слизистой прямой кишки эмбриона коровы (FBG), слизистой трахеи эмбриона коровы (FBTR), почки теленка (Т-1 и ПТ), почки коровы (МДВК), коронарных сосудов теленка (КСТ), легкого эмбриона коровы (ПЛЭК), почки эмбриона овцы (FLK), почки зеленой мартышки (46/47), почки макаки-резус (МА-104), фибробластов куриных эмбрионов (CEF), почки хомячка (ВНК21), карциномы человека (HeLa).
Для культивирования клеток и вируса применяли питательные среды ГЛА, 199, Игла (с добавлением 3 % глутамина), Игла МЕМ, Игла МЕМ (×10), RPMI-1640 с добавлением 10; 5 и 2 % сыворотки крови КРС, телят, фетальной КРС, северных оленей, цыплят. Монослойные культуры клеток отмывали раствором Хенкса. В среды и растворы добавляли антибиотики по 100 ЕД/мл. При получении клеточных культур и размножении вируса использовали 0,25 % раствор трипсина, 0,01 % раствор химопсина в 0,02 % растворе версена, 7,5 % раствор бикарбоната натрия. Исходный титр вируса (lg ТЦД 50/мл) при заражении составлял 1,5-3,0. Вирус культивировали при температуре 37 °С в стационарных условиях.
Инфекционную активность РС-вируса в культуре клеток определяли по цитопатическому действию (ЦПД) титрованием микро- и пробирочным методом, инфекционный титр рассчитывали по L. Reed и H. Muench (17), выражая в lg ТЦД 50/мл (ТЦД 50 — 50 % тканевая цитопатическая доза). Чувствительность культур клеток к РС-вирусу оценивали с учетом времени проявления ЦПД в 5 серийных пассажах. В чувствительной культуре клеток вирус адаптировали в 5-10 серийных пассажах.
Для статистической обработки данных использовали методические указания Н.В. Пушкарева и А.Д. Соболева (18).
Результаты. Штамм РС-Б РС-вируса КРС репродуцировался во всех используемых монослойных первично трипсинизированных культурах клеток (ТЭК, ПЭК, ЛЭК, ТБ) и их субкультурах. По величине инфекционного титра (lg ТЦД 50/мл) культуры ранжировались в последовательность ЛЭК (3,36±0,17), ПЭК (3,20±0,15) и ТБ (3,04±0,04). Наименьшее накопление вируса отмечали в органной культуре клеток ЭЛЭК. Все изученные диплоидные культуры клеток были чувствительны к штамму РС-Б, но большей чувствительностью обладали культуры Л5Э (3,98±0,38) и П5Э (3,96±0,33), в которых характерное для РС-вируса ЦПД проявлялось на 2-4-е сут после заражения на протяжении 5 пассажей (в этих культурах титр вируса был наибольшим по опыту). В культурах клеток Т3Э, С3Э и особенно ДЛЭК репродуктивная активность вируса оказалась низкой.
Из перевиваемых линий клеток КРС нечувствительными к штамму РС-Б были FBG, FBN, FBTR, низкую чувствительность имели МДВК, ПЛЭК и КСТ, чувствительность проявила линия Т-1 (3,63±0,11), в которой на протяжении 5 пассажей было выражено ЦПД, и ПТ (титр вируса — 3,43±0,09). Из двух линий клеток обезьян слабой чувствительностью к штамму РС-Б обладала культура МА-104, чувствительной оказалась линия 46/47 (3,40±0,11). Наибольшая чувствительность отмечалась у линии овечьих

клеток FLK (3,74±0,12). В перевиваемой линии CEF вирус выявляли лишь в первых 3 пассажах. Линии клеток ВНК21 и HeLa были слабо чувствительными к штамму, и накопление вируса в этих культурах снижалось по мере пассирования.
Штамм РС-Р РС-вируса КРС с первого пассажа проявил большую активность, репродуцируясь в первично трипсинизированных культурах клеток: титр вируса составил в ПЭК — 3,51±0,09, в ТБ — 3,43±0,09 и в ЛЭК — 3,61±0,05. ЦПД вируса проявлялось на 2-4-е сут после инокуляции культуры клеток и было выраженнее, чем у штамма РС-Б. Дальнейшее культивирование вируса РС-Р с использованием ЛЭК (5-10 пассажей) позволило повысить титр до 4,01±0,09-4,75±0,07. Затем адаптировали штамм к перевиваемым линиям клеток Т-1 и ПТ, в которых титр вируса в сред-нем составил 3,0-4,0.
Таким образом, наиболее чувствительными к штамму РС-Б респираторно-синцитиального вируса (РС-вируса) крупного рогатого скота (КРС) оказались диплоидные культуры клеток легкого (Л5Э) и почки (П5Э) эмбриона коровы, перевиваемые линии почки эмбриона овцы (FLK) и почки теленка (Т-1, ПТ) и первично трипсинизированная культура клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК): титр вируса (lg ТДЦ 50/мл) составил соответственно 3,98±0,38; 3,96±0,33; 3,74±0,12; 3,63±0,11; 3,43±0,09 и 3,36±0,17. Штамм РС-Р РС-вируса КРС проявил большую инфекционную активность по сравнению со штаммом РС-Б в отношении клеточных культур. Из первично трипсинизированных культур наиболее чувствительной оказалась культура клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК, титр вируса — 3,61±0,05-4,75±0,07). Последующая адаптация штамма к перевиваемым линиям клеток Т-1 и ПТ позволила получить средний титр вируса (lg ТДЦ 50/мл) 3,0-4,0.

Л и т е р а т у р а

1. Г у л ю к и н  М.И.,  Ю р о в  К.П.,  К а р а в а е в  Ю.Д. Система ветеринарно-санитарных, профилактических и лечебных мероприятий против инфекционных болезнях рогатого скота в хозяйствах Российской Федерации. М., 2007: 14.
2. К о с т ы р к и н  Ю.А.,  М и щ е н к о  В.А.,  Д у м о в а  В.В.,  Л и с и ц ы н  В.В.,  Н и к е ш и-
н а  Т.Б.,  К у х а р к и н а  О.В.,  К о н о н о в  А.В. Эффективность инактивированной вакцины при факторных респираторных болезнях телят. Ветеринарная патология, 2005, 3(14): 72-75.
3. Г а л о ч к и н  В.А.,  Г а л о ч к и н а  В.П.,  О с т р е н к о  В.П. Разработка теоретических основ и создание антистрессовых препаратов нового поколения для животноводства. С.-х. биол., 2009, 2: 43-55.
4. J e a n - F r a n c o i s  V.,  G e r a l d i n e  T. Bovine respiratory syncytial virus infection. Vet. Res., 2007, 38: 153-180.
5. L a r s e n  G.E. Bovine respiratory syncytial virus (BRSV): A review. Acta Vet. Scand., 2000, 41: 1-24.
6. V a l a r c h e r  J.F.,  T a y l o r  I.G.,  B o v i n e  J.F. Respiratory syncytial virus infection. Vet. Res., 2007, 8: 153-180. 
7. Г у н е н к о в  В.В.,  Х а л е н е в  Г.А.,  С ю р и н  В.Н. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция. Животноводство и ветеринария, 1975, 8: 70-76. 
8. В а с и л ь е в  А.В.,  О с и д з е  Н.Г.,  С ю р и н  Н.В.,  А к б а е в а  Л.М.,  С т р о г а-
н о в а  И.Я.,  Б а р и н в а  Л.И. РНГА в серодиагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. Ветеринария, 1988, 10: 33-34.
9. С т р о г а н о в а  И.Я.,  Г л о т о в  А.Г. Распространение респираторно-синцитии- альной инфекции крупного рогатого скота. Сиб. вест. с.-х. науки, 2009, 12: 87-91.
10. С h a l a l  V.D.,  E l a z h a r y  V. The pathogenesis of bovine respiratory syncytial virus infection in lung organ cultures. Abstrs 79th Annu. Mett. Amer. Soc. Microbiol. Los Angeles, Califоrnia, 1979.
11. W e s t e n b r i n k  F.,  B r i n k h o f  M.A.,  S t r o s e r  P.J. Comporaison of a newly developed enzyme-linked immunosorbent assay with complement fixation and neutralization test for serology of bovine respiratory syncytial virus infections. Res. Vet. Sci., 1985, 38(3): 334-340.
12. M a t u m o t o  М.,  I n a b a  Y.,  K u r o g i  H.,  S a t o  K.,  O m o r i  T.,  C o t o  Y., H i r o s e  O. Bovine respiratory syncytial virus: host range in laboratory animals and cell cultures. Arch. Ges. Virusforsch., 1974, 44: 280-290.
13. С h a r l i e r  G.,  W e l l w m a n s  G.,  L a l e  A., Strobbe R. Propagation of bovine respiratory syncytial virus in calf testicle microcarrier culture. Arch. Exp. Vet. Med, 1984, 38(6): 894-899.
14. Х а р а л а м б и е в  Х.Е.,  Б о с т а н ж и е в а  Р.М.,  Г е о р г и е в  Г.К.,  М и т о в  Б. Изоляция на респираторно-синцитиальния вирус от телят с репираторни заболевания. Вет. мед. науки (София), 1984, XXI(2): 3-7.
15. O d e g a a r d  О.А.,  K r o g s r u d  J. А field outbreak caused by bovine respiratory syncytial virus. Acta Vet. Scand., 1977, 18: 429-431.
16. H a r a l a m b i e v  H.E.,  B o s t a n d j i e v a  R.M.,  G e o r g i e v  G.К. Cultivation of bovine respiratory syncytial virus on cell line FLK and other cell cultures of sheep origin. Comptes rendus de 1 Akademie Bulgare des Sciences, 1982, 35(11): 1611-1613.
17. R e e d  L.J.,  M u e n c h  H.A. A simple method of estimating 50 percent endpoints. Am. J. Hug., 1938, 27: 131-159.
18. П у ш к а р е в  Н.В.,  С о б о л е в  А.Д. Основы вариационной статистики: методические указания для аспирантов зооветеринарных специальностей. М., 1983.

INFECTIOUS ACTIVITY OF CATTLE RESPIRATORY-SINCITIAL VIRUS IN CELL CULTURES

I.Ya. Stroganova¹, L.M. Akbaeva²

The authors studied the sensitivity of 27 cell cultures (organ culture, monolayer primary trypsin cultures and their subcultures, diploid, transplantable lines) to RS-B and RS-R strains of respiratory-sincitial virus of cattle. The diploid cultures of lung and kidney of cow’s embryo, the transplantable lines of kidney of sheep and calf embryos, the calf kidney and primary trypsin culture of lung of cow’s embryo are the most sensitive to RS-B strain. The RS-R strain reveals greater infectious activity than RS-B strain.

Keywords: respiratory syncytial virus, cattle, cell cultures.

Оформление электронного оттиска