УДК 619:571.27:57.086.8
МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КАК ИММУНОСУПРЕССОРЫ В КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ (обзор)
О.C. РОГОВАЯ, М.С. КРАСНОВ, Е.В. КОСОВСКАЯ, Г.Ю. КОСОВСКИЙ
Обсуждаются биологические основы и практические примеры применения клеточной терапии у сельскохозяйственных животных. Рассмотрены положительные результаты, полученные при лечении патологий суставов и сухожилий у племенных лошадей, примеры использования мезенхимных стволовых клеток (МСК) при эндопротезировании. Показано, что котрансплантация мезенхимных стволовых клеток снижает вероятность развития реакции «трансплантат против хозяина». Феномен супрессии реципиента может найти практическое применение в комплексном лечении сельскохозяйственных животных, в частности при аутоиммунных заболеваниях (например, при сахарном диабете I типа).
Ключевые слова: мезенхимные стволовые клетки, трансплантация, иммуносупрессия, клеточная терапия, сахарный диабет.
Мезенхимные стволовые клетки (МСК) представляют значительный интерес как для биотехнологии, так и для ветеринарии и в последнее время находят все большее практическое применение. Они способны дифференцироваться в различные типы клеток соединительной ткани, обладают низкой иммуногенностью и проявляют выраженные иммуносупрессивные свойства. Наиболее доступным источником полноценных МСК служит жировая ткань. Фенотипически МСК жировой ткани идентифицируют по наличию следующих белковых маркеров клеточной поверхности: SH-2, SH-3, SH-4, STRO-1, Sca-1, Thy-1, CD44, CD29, CD71, CD120a, CD124, CD105, CD54, CD117, CD49d. В то же время маркеры CD34, CD45, CD140, CD106 у них не экспрессируются, что отличает МСК жировой ткани от гематопоэтических стволовых клеток. Данные литературы свидетельствуют, что МСК, трансплантируемые иммуносостоятельным организмам, не вызывают отторжения (1-3), кроме того, сообщается об иммуносупрессивных свойствах МСК (4-6). Эти результаты легли в основу исследований, направленных на выяснение возможностей применения МСК в профилактике или лечении реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ), воспалительных процессов и аутоиммунных заболеваний (7-10). В клинических исследованиях на пациентах было показано, что котрансплантация МСК и гемопоэтических клеток существенно (до 15 %) снижала вероятность развития реакции РТПХ (11). При трансплантации МСК в случаях с уже развивающейся РТПХ последняя проявлялась значительно слабее. Исходя из положительного опыта применения МСК в лечении различных патологий у человека, можно прогнозировать, что использование клеточных технологий в качестве инструмента лечения и регуляции иммунного ответа у животных весьма перспективно.
Несомненно, «золотым стандартом» клеточной терапии служит аутологичная трансплантация. Тем не менее, изучение возможностей аллогенной трансплантации МСК также представляет интерес в связи с их особой ролью в лимфопоэзе, в частности в положительной селекции Т-лимфоци-тов, что подразумевает подобный характер взаимодействия донорских МСК с клетками реципиента и, в свою очередь, позволяет осуществлять аллогенную трансплантацию несовместимых по антигенам клеток без сопутствующей иммуносупрессии. Так, МСК не лизируются в смешанных культурах аллогенными Т-лимфоцитами и NK-клетками (12). МСК in vitro значительно ингибируют пролиферацию Т-лимфоцитов в ответ на активацию поликлональными стимуляторами, специфическими антигенами или антигенпрезентирующими клетками, что отмечается при соотношении МСК и Т-клеток 1:10, а в отдельных работах и при соотношении 1:100. Кроме того, МСК снижают экспрессию активационных маркеров CD25, CD38, CD69 у лимфоцитов, уменьшают секрецию g-интерферона. Причем отмеченные эффекты сохраняются после дифференцировки МСК (12) и обратимы при удалении МСК из культуры (13).
Установлено, что толерантность к МСК со стороны иммунной системы реципиента не обусловлена отсутствием или слабой экспрессией некоторых молекул комплекса гистосовместимости (ГКГ) на поверхности клеток. Была обнаружена высокая степень экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости I класса и отсутствие антигенов ГКГ II класса, которые выявлялись внутриклеточно (12). После добавления в культуру g-интерферона молекулы ГКГ II класса начинали экспрессироваться и на клеточной поверхности. Влияние МСК на пролиферацию Т-клеток было показано не только в смешанных культурах, но и в опытах с использованием полупроницаемых мембран. В роли медиаторов, влияющих на Т-клет-ки, выступали трансформирующий фактор роста бета (ТGF-b) и фактор роста гепатоцитов (HGF). Добавление этих факторов непосредственно в среду культивирования также снижало пролиферацию Т-клеток (13).
В экспериментах in vivo при аллогенной трансплантации МСК и их дифференцировке не отмечалось иммунологических реакций отторжения при отсутствии иммуносупрессии, что согласуется с приведенными выше данными. Вместе с тем в некоторых работах указывается на снижение иммунотолерантности к трансплантируемым МСК при их хондрогенной дифференцировке (14, 15).
К положительному опыту клеточной терапии с помощью МСК в ветеринарии относятся результаты, полученные при различных патологиях суставов и сухожилий у племенных лошадей. Кроме того, теоретически и экспериментально прорабатываются другие перспективные подходы для использования МСК, например при эндопротезировании у животных. Феномен иммуносупрессии реципиента МСК также может найти практическое применение при лечении аутоиммунных заболеваний у животных, в частности сахарного диабета I типа.
В основном при лечении лошадей и в экспериментах на лабораторных животных применяли первичные (смешанные) культуры клеток, выделенных из разных источников, а также клетки после культивирования и дифференцировки in vitro (16-22). Есть сообщения об использовании клеточных суспензий, прошедших сепарацию по определенным поверхностным клеточным маркерам, для лечения экспериментального инфаркта у лабораторных крыс (23). Вариант с первичной (смешанной) культурой клеток имеет свои преимущества (исключается весьма трудоемкий и затратный этап культивирования клеток), однако к существенным недостаткам этого приема следует отнести невозможность достоверно оценить, какие именно клетки вводятся пациенту. В частности, присутствие в гетерогенной суспензии макрофагов, нейтрофилов может отрицательно сказаться на его иммунном статусе. Сепарация клеточной суспензии по поверхностным маркерам решает эту проблему, но требует точного подбора комплекса дорогостоящих моноклональных антител для идентификации пула стволовых клеток и весьма значительного объема исходного донорского материала. В связи с этим проблема оптимизации способа масштабирования МСК в культуре перед трансплантацией остается в настоящее время актуальной.
Следует отметить, что до сих пор нет четких и достаточных обоснований выбора групп больных особей, которым рекомендована клеточная терапия, времени трансплантации и эффективных доз трансплантируемых МСК как по видам животных и характеру поражений, так и собственно по типу стволовых клеток. В то же время опубликованные результаты работ по терапевтическому использованию МСК у лошадей (16-19, 22, 23) свидетельствуют о высокой эффективности такого подхода на фоне общей стандартной терапии при лечении пораженных сухожилий мышц-сги-бателей. У скаковых лошадей, прошедших клеточную терапию (введение суспензии МСК), воспаление в пораженных тканях значительно уменьшалось, при этом общее состояние улучшалось.
Известны немногочисленные исследования относительно возможностей включения МСК в технологии эндопротезирования органов или частей органов у сельскохозяйственных животных. Так, на овцах были выполнены трансплантации целого сустава, причем для восстановления хрящевой ткани применяли аутологичные клетки (24, 25). В. Carstanjen и соавт. (24) использовали иммуносупрессивные свойства МСК при трансплантации лошадям мягких тканей верхнего неба при врожденном дефекте («волчья пасть»). Суспензию клеток вводили в место прикрепления трансплантата, в результате чего эффективность его приживления значительно повышалась на общем фоне подавления воспалительных процессов (25). Иными словами, эффект сопутствующей терапии при трансплантациях органов и тканей удается повысить благодаря иммуносупрессивным свойствам МСК.
Как уже отмечалось, еще одно перспективное направление для применения современных методов клеточной терапии — лечение сахарного диабета (СД) у домашних и сельскохозяйственных животных. Как известно, СД — эндокринное заболевание, которое проявляется в состоянии хронической гипергликемии, связанной с нарушением метаболизма глюкозы. Болезнь часто поражает собак, кошек (26), а также свиней, овец и крупный рогатый скот (27-31). С каждым годом на фоне распространения этой патологии актуальность проблемы повышается.
Одним из прогрессивных методов лечения инсулинозависимого диабета признана трансплантация островковых клеток поджелудочной железы в печень пациента. В 1960-е годы были разработаны методы очистки островков поджелудочной железы от соединительной и внешнесекреторной ткани с помощью коллагеназы (32). В дальнейшем провели экспериментальные и клинические исследования, при которых суспензию островковых клеток трансплантировали разными способами и в различные ткани: инъекциями в портальную вену (то есть в печень), в селезеночную вену и в селезенку, в пульпу селезенки; инъекцией и имплантацией в брюшную полость; пересадкой (трансплантация или инъекция) под капсулу почки; инъекцией в прямую мышцу живота; имплантацией в подкожную жировую клетчатку передней стенки живота; имплантацией культуры предварительно инкапсулированных (макро- и микроинкапсулирование) островковых клеток (33-35). К сожалению, попытки отечественных и зарубежных ученых применить свободную трансплантацию культуры островковых клеток, полученных из эмбрионов человека и крупного рогатого скота, а также от новорожденных поросят или кроликов, не дали желаемого результата по ряду причин. Так, отсутствует возможность выделения и практически полной очистки островков клеток поджелудочной железы от соединительной ткани, антигены которой служат инициаторами иммунного отторжения и аутоиммунной деструкции пересаженных тканей. Для единовременной пересадки требуется не менее 1 000 000 островков, что затруднено из-за отсутствия аппаратуры для автоматической сепарации и подсчета островков, которые в течение ограниченного времени должны быть получены и пересажены больному (33-35). В связи с этим широко ведутся поиски альтернативных продуцирующих инсулин клеток. В частности, ими могут быть МСК.
Группа итальянских ученых из San Raffaele Scientific Institute (г. Милан) исследовала человеческие МСК из культуры экзокринной и эндокринной ткани поджелудочной железы. Проверялась гипотеза о том, что именно они представляют собой панкреатические стволовые клетки и их происхождение отчасти экстрапанкреатическое. Действительно, последнее предположение было доказано в опытах на мышах, которым трансплантировали клетки костного мозга от генетически меченных GFP+-мышей. CD45+-клетки костного мозга дифференцировались в панкреатические МСК. Степень экспрессии специфических для островковых клеток генов у них оказалась пренебрежимо мала и не зависела от условий культивирования. Поэтому был сделан вывод о малой вероятности такого события, как дифференцировка этих клеток в физиологически компетентные b-клетки. В то же время при совместной трансплантации минимального количества панкреатических островков и МСК последние способствовали установлению нормогликемии и неоваскуляризации донорской ткани (36-38). В настоящее время ряд исследователей объясняют усиление синтеза инсулина и общее улучшение состояния лабораторных животных с инсулинозависимым сахарным диабетом тем, что МСК ведут себя в описанной модели как иммуносупрессоры, подавляющие проявление аутоиммунного фактора СД.
Таким образом, применение МСК в ветеринарии в настоящее время связывают с их участием в процессах регенерации тканей (в которых МСК скорее играют вспомогательную роль, чем обеспечивают собственно восстановление) и/или способностью оказывать иммуносупрессорное действие. Практическим результатом ведущихся разработок могли бы стать методы, предусматривающие совместную трансплантацию (котрансплантацию) как органов и тканей, так и клеток (например, островковых) с МСК, которые позволили бы значительно повысить эффективность лечения, снизив при этом его стоимость.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. M a k k a r R.R., P r i c e M.J., L i l l M. e.a. Intramyocardial injection of allogenic bone marrow-derived mesenchymal stem cells without immunosuppression preserves cardiac function in a porcine model of myocardial infarction. J. Cardiovasc. Pharmacol. Ther., 2005, 10(4): 225-233.
2. D a i W., H a l e S.L., M a r t i n B.J. e.a. Allogeneic mesenchymal stem cell transplantation in postinfarcted rat myocardium: short- and long-term effects. Circulation, 2005, 112(2): 214-223.
3. K r a i t c h m a n D.L., T a t s u m i M., G i l s o n W.D. e.a. Dynamic imaging of allogeneic mesenchymal stem cells trafficking to myocardial infarction. Circulation, 2005, 112(10): 1451-1461.
4. A u g e l l o A., T a s s o R., N e g r i n i S.M. e.a. Bone marrow mesenchymal progenitor cells inhibit lymphocyte proliferation by activation of the programmed death 1 pathway. Eur. J. Immunol., 2005, 35(5): 1482-1490.
5. S a t o K., O z a k i K., O h I. e.a. Nitric oxide plays a critical role in suppressionof T-cell proliferation by mesenchymal stem cells. Blood, 2007, 109: 228-234.
6. R e n G., Z h a n g L., Z h a o X. e.a. Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression occurs via concerted action of chemokines and nitric oxide. Cell Stem Cell 2008, 2: 141-150.
7. T i s a t o V., N a r e s h K., G i r d l e s t o n e J., N a v a r r e t e C., D a z z i F. Mesenchymalstem cells of cord blood origin are effective at preventing but not treating graft-versus-host disease. Leukemia, 2007, 21: 1992-1999.
8. A k s u A.E., H o r i b e E., S a c k s J. е.a. Co-infusion of donor bone marrowwith host mesenchymal stem cells treats GVHD and promotes vascularized skin allograft survival in rats. Clin. Immunol., 2008, 127(3): 348-358 .
9. T i a n Y., D e n g Y.B., H u a n g Y.J., W a n g Y. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells decrease acute graft-versus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cells transplantation. Immunol. Invest., 2008, 37: 29-42.
10. B a c i g a l u p o A. Management of acute graft-versus-host disease. Br. J. Haematol., 2007, 137: 87-98.
11. F r a s s o n i F.L.M., B a c i g a l u p o A., G l u c k m a n E. Expanded mesenchymal stem cells (MSC), coinfused with HLA identical hemopoietic stem cell transplants, reduce acute and chronic graft versus host disease: a matched pair analysis. Bone Marrow Transplant., 2002, 29: 75.
12. L e B l a n c K., T a m m i k C., R o s e n d a h l K. e.a. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp. Hematol., 2003, 31: 890-896.
13. R a s m u s s o n I., R i n g d e n O., S u n d b e r g B. e.a. Mesenchimal stem cells inhibit lymphocyte proliferation by mitogens and alloantgens by different mechanisms. Exp. Cell Res., 2005, 305: 33-41.
14. D j o u a d F., P l e n c e P., B o n y C., T r o p e l P., A p p a r a i l l y F., S a n y J., N o ë l D., J o r g e n s e n C. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals. Blood, 2003, 102: 3837-3844.
15. P a r s c h D., F e l l e n b e r g J., B r ü m m e n d o r f T.H., E s c h l b e c k A.M., R i-
c h t e r W. Telomere length and telomerase activity during expansion and differentiation of human mesenchymal stem cells and chondrocytes. J. Mol. Med., 2004, 82(1): 49-55.
16. G u e s t D.J., S m i t h M.R., A l l e n W.R. Monitoring the fate of autologousand allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: Preliminary study. Equine Vet. J., 2008, 40: 178-181.
17. S m i t h R.K., K o r d a M., B l u n n G.W., G o o d s h i p A.E. Isolation and implantationof autologous equine mesenchymal stem cells from bone marrow into the superficial digital flexor tendon as a potential novel treatment. Equine Vet. J., 2003, 35: 99-102.
18. P a c i n i S., S p i n a b e l l a S., T r o m b i L. e.a. Suspension of bone marrow derived undifferentiated mesenchymal stromal cells for repair of superficial digital flexor tendon in race horses. Tissue Eng., 2007, 13(12): 2949-2955.
19. W i l k e M.M., N y d a m D.V., N i x o n A.J. Enhanced early chondrogenesis in articular defects following arthroscopic mesenchymal stem cell implantation in an equine model. J. Orthop. Res., 2007, 25: 913-925.
20. A b d a l l a h B.M., K a s s e m M. Human mesenchymal stem cells: From basic biology to clinical applications. Gene Ther., 2008, 15: 109-116.
21. B r o o k e G., C o o k M., B l a i r C. е.a. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin. Cell Dev. Biol., 2007, 8: 846-858.
22. O e r t e l M., M e n t h e n a A., C h e n Y.Q., T e i s n e r B., J e n s e n C.H., S h a-
f r i t z D.A. Purification of fetal liver stem/progenitor cells containing all the repopulation potential for normal adult rat liver. Gastroenterology, 2008, 134: 823-832.
23. C r o v a c e A., L a c i t i g n o l a L., D e S i e n a R., R o s s i G., F r a n c i o s o E. Cell therapy for tendon repair in horses: An experimental study. Vet. Res. Commun., 2007, 31(Suppl. 1): 281-283.
24. C a r s t a n j e n B., D e s b o i s C., H e k m a t i M., B e h r L. Successful engraftment of cultured autologous mesenchymal stem cells in a surgically repaired soft palate defect in an adult horse. Can. J. Vet. Res., 2006, 70: 143-147.
25. P i l l i a r R.M., K a n d e l R.A., G r y n p a s M.D., Z a l z a l P., H u r t i g M. Osteochondral defect repair using a novel tissue engineering approach: Sheep model study. Technol. Health Care, 2007, 15: 47-56.
26. K a n d e l R.A., G r y n p a s M.D., P i l l i a r R.M. e.a. Repair of osteochondral defects with biphasic cartilage-calcium polyphosphate constructs in a sheep model. Biomaterials, 2006, 27: 4120-4131.
27. Ф е л ь д м а н Э., Н е л ь с о н Р. Эндокринология и репродукция собак и кошек. М., 2008.
28. B a k e r L.H., R e i d J.J., O w e n M. Diabetic coma of feed-lot sheep. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1931, 79: 97-99.
29. B i e s t e r H.E. Diabetes in a pig showing pancreatic lesions. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1925, 67: 99-109.
30. B o m m e r G., M o r o h o s h i T., D r e n k C.R., O b e r h o l z e r M., H e i t z P.U., K l o p p e l G. Immunzytochemische Morphometric am endokrinen Pankreas juveniler und adulter Diabetiker. Verh. Dtsch. Ges. Pathol., 1981, 65: 387-390.
31. T a n i y a m a H., S h i r a k a w a T., U r u o k a H.F. e.a. Spontaneous diabetes mellitus in young cattle: histologic, immunohistochemical, and electron microscopic studies of the islets of Langerhans. Vet. Pathol., 1993, 30(1): 46-54.
33. С к а л е ц к и й Н.Н., К и р с а н о в а Л.А., Б а р а н о в а Н.В. и др. Получение культур островковых клеток для трансплантации: новые подходы и новое качество. Вест. трансплантологии и искусственных органов, 2002, 3: 86.
34. С к а л е ц к и й H.H., К и р с а н о в а Л.А., Б л ю м к и н В.Н. В кн.: Проблемы трансплантологии и искусственных органов. М., 1994: 73-80.
35. S u t h e r l a n d D.E., G r u e s s n e r R.W., D u n n D.L. e.a. Lessons learned from more than 1000 pancreas transplants at a single institution. Ann. Surg., 2001, 233: 463-501.
36. C a l a f i o r e R., B a s t a G., L u c a G. e.a. Microencapsulated pancreatic islet allografts into nonimmunosuppressed patients with type I diabetes: First two cases. Diabetes Care, 2006, 29: 137-138.
37. S o r d i V.I., M e l z i R.I., M e r c a l l i A.I. e.a. Mesenchymal cells appearing in pancreatic tissue culture are bone marrow-derived stem cells with the capacity to improve transplanted islet function. J. Pancreas, 2009, 10(5): 589-645.
38. F i o r i n a P., S h a p i r o A.M.J., R i c o r d i C., S e c c h i A.Am. FEM-based oxygen consumption and cell viability models for avascular pancreatic islets. J. Transplant., 2008, 8(10): 1990-1997.
MESENCHYMAL STEM CELLS (MSC) AS AGENTS, REDUCING IMMUNOGENICITY OF THE GRAFT (review)
O.S. Rogovaya, M.S. Krasnov, E.V. Kosovskaya, G.Yu. Kosovsky
Cell therapy in the treatment of farm animals is increasingly used: the positive results obtained for treatment of the joints and tendons pathologies in breeding horses. In addition, at present it is shown that MSCs co-transplantation reduces the development of reaction «graft vs. host disease». The phenomenon of suppression of the recipient may find practical application in complex treatment of farm animals, in particular autoimmune diseases in animals, such as type I diabetes.
Keywords: mesenchymal stem cells, transplantation, immunosuppression, cell therapy, diabetes mellitus.
Филиал экспериментальной эмбриологии и |
Поступила в редакцию |
