УДК 636.2:591.23:57.083

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ДИСБАКТЕРИОЗЕ КИШЕЧНИКА У ТЕЛЯТ

А.В. МОТОРЫГИН, Е.М. ЛЕНЧЕНКО

Провели сравнительную оценку количественного и качественного состава популяций патогенных и условно-патогенных микроорганизмов при дисбактериозе кишечника у телят голштинской и черно-пестрой породы с использованием методов прижизненной и посмертной диагностики. Наиболее эффективным для прижизненной диагностики признан метод окраски карболовым фуксином по Циль-Нильсену, для посмертной — метод мазков-отпечатков. Использование хромогенных сред позволяет провести ускоренную дифференциацию энтеробактерий. Применение щадящих методов фиксации и обезвоживания объектов дает возможность наблюдать за процессами роста и развития популяций микроорганизмов.

Ключевые слова: дисбактериоз, телята, энтеробактерии, микроскопия, питательные среды.

 

Контаминация объектов окружающей среды патогенными и условно-патогенными микроорганизмами — одна из причин распространения инфекционных заболеваний. Воздействие возбудителей зоонозов и зооантропонозов наряду с бесконтрольным использованием химиотерапевтических средств нередко приводит к развитию дисбактериоза — изменения количественного и качественного состава микрофлоры в слизистой оболочке кишечника. В последние десятилетия наблюдается тенденция к увеличению числа факторов, способствующих развитию дисбактериозов, которые с трудом поддаются лечению (1-5).
Как правило, для диагностики дисбактериоза и оценки эффективности препаратов проводят длительные бактериологические исследования, требующие серьезных затрат на питательные среды. В качестве ориентировочной диагностики можно использовать микроскопические методы, имеющие очевидные преимущества по времени и технике подготовки препаратов. Однако при микроскопии возникают определенные сложности, например при дифференциации кислотоустойчивых микроорганизмов и ооцист простейших.
В задачи настоящей работы входили апробация и подбор эффективных методов оценки количественного и качественного состава популяций патогенных и условно-патогенных микроорганизмов при дисбактериозе кишечника у телят.
Методика. Исследования проводили в ООО «Колхоз им. В.Г. Пряхина» (Кораблинский р-н, Рязанская обл., 2009 год) на телятах голштинской и черно-пестрой породы (n = 10) в возрасте от 2 нед до 1 мес, которых подбирали по принципу аналогов (одинаковый возраст, пол, живая масса; условия кормления и содержания — принятые в хозяйстве). Животных разделили на две группы (по 5 гол. в каждой): телята с признаками диареи, дегидратации, токсемии (опыт) и клинически здоровые (контроль). Инфекционные желудочно-кишечные заболевания диагностировали на основании результатов бактериологического исследования, клинических признаков болезни, патологоанатомических и эпизоотологических данных.
Для идентификации микроорганизмов применяли бактериологические и микологические методы (4, 5). При прижизненной диагностике на предметное стекло наносили 2 капли изотонического (0,9 %) раствора хлорида натрия и небольшое количество фекалий. Готовили тонкий мазок, который высушивали на воздухе (30 мин), крупные частицы удаляли скальпелем. Фиксировали в течение 15 мин смесью Никифорова (равные части эфира и 96° этилового спирта). Препараты окрашивали сафранином, нигрозином или карболовым фуксином по Циль-Нильсену (6). При посмертной диагностике исследовали мазки-отпечатки из слизистой оболочки подвздошной кишки павших или убитых телят из опытной и контрольной групп. Предметное стекло прикладывали непосредственно к слизистой оболочке, полученный отпечаток высушивали и фиксировали над пламенем горелки. Исследуемые мазки окрашивали по Граму и метиленовым синим. Для выявления особенностей морфологии бактерий и микроскопических грибов применяли новый методологический подход, позволяющий исследовать колонии микроорганизмов без нарушения естественной архитектоники (6).
В опытах использовали грибы Aspergillus spp., выделенные из зерна и грубых кормов, предназначенных для крупного рогатого скота, а также бактерии Escherichia spp. и дрожжеподобные грибы Candida spp., полученные из патологоанатомического материала и экскрементов телят. Исследование проб зерна осуществляли согласно ГОСТу (7, 8). Микроорганизмы культивировали на мембранных фильтрах, размещенных на поверхности агаризованных питательных сред (стандартный дифференциально-диагно-стический набор) в чашках Петри в оптимальных для исследуемого вида условиях. Выросшие на фильтрах колонии фиксировали парами 25 % раствора глутарового альдегида (40 мин), затем парами 1 % раствора осмиевой кислоты (5 мин).
Подготовку препаратов для световой, сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии осуществляли по общепринятым (4) и разработанным нами методам. Использовали электронный микроскоп Hitachi-800 («Hitachi», Япония) со сканирующей приставкой Hitachi-8010 (напряжение 75 кВ). Образцы, предназначенные для исследования в сканирующем электронном микроскопе, напыляли золотом на установке Е-102 («Hitachi», Япония).
Результаты исследований обрабатывали методом вариационной статистики в программе SPPS Statistics (9).
Результаты. При использовании раствора сафранинамикроорганизмы не окрашивались, а ооцисты простейших приобретали бледно-розо-вый цвет. После негативного окрашивания нигрозином ооцисты имели вид прозрачных круглых образований диаметром 5 мкм, снаружи выявлялся отчетливый черный ободок, однако эти препараты быстро выцветали, поэтому оказались непригодными для длительного хранения. При окрашивании карболовым фуксином по Циль-Нильсену кислотоустойчивые бактерии и дрожжеподобные грибы можно было дифференцировать от ооцист простейших, которые окрашивались в разные оттенки ярко-красного цвета и имели вид округлых образований диаметром до 5 мкм. Кроме того, последний метод позволял выявить капли жироподобных веществ и гранулы детрита по отсутствию отчетливой оболочки и какого-либо структурированного содержимого внутри. Окраска сохранялась в течение многих месяцев.
По данным литературы, исследование мазков-отпечатков, окрашенных по Граму, в 75 % случаев позволяет устанавливать этиологический фактор инфекционных и паразитарных заболеваний у телят (10). Если при микроскопии препаратов мы обнаруживали чистую культуру грамотрицательных мелких палочек с закругленными концами, расположенных группами, то ставили ориентировочный диагноз эшерихиоз. Наличие почкующихся клеток яйцевидной или утолщенной формы указывало на кандидомикоз. Окончательный диагноз подтверждали бактериологическими и микологическими исследованиями, включающими три основных этапа: посев материала в чашки Петри с дифференциально-диагностическими средами; выделение чистой культуры с первичной дифференциацией на комбинированных питательных средах; идентификацию микроорганизмов по комплексу биохимических признаков (табл.).

Сравнительная характеристика состава микрофлоры в кишечнике у здоровых и больных дисбактериозом телят голштинской и черно-пестрой породы (ООО «Колхоз им. В.Г. Пряхина», Кораблинский р-н, Рязанская обл., 2009 год)

Микроскопическая
характеристика

Режим культивирования, разведение

Группа микроорганизмов

Наличие/отсут-ствие (+/-)

контроль

опыт

Грамположительные палочки в форме цифры V с утолщениями на концах, скопления клеток имеют вид китайских иероглифов

Модифицированная среда Blaurock («HiMedia», Индия); 37 °С, 48 ч; 10-3-10-10

Bifidobacteriumspp.

+

-

Почкующиеся клетки яйцевидной или утолщенной формы

Агар Сабуро («HiMedia», Индия); 37 °С, 48 ч; 10-3-10-10

Candida spp.

-

+

Грамотрицательные палочки, расположены группами или короткими цепочками

Агар Эндо («Merck», Германия); 37 °С, 24 ч; 10-3-10-10

Лактозанегативные энтеробактерии и бактерии со слабой лактозной активностью

-

+

Кровяной агар («Merck», Германия); 37 °С, 24 ч; 10-3-10-10

Гемолитические  штаммы Escherichia coli

-

+

При уменьшении количества облигатной микрофлоры в биотопе желудочно-кишечного тракта освобождаемая экологическая ниша заселялась патогенными, условно-патогенными бактериям и микроскопическими грибами. В частности, микроорганизмы Bifidobacterium spp. были выделены в 1 г фекалий у клинически здоровых телят в разведениях 10-3-10-10, тогда как не обнаруживались при диарее, токсемии и дегидратации. У животных из контрольной группы подавляющее большинство эшерихий было представлено лактопозитивными штаммами. В опытной группе доля этих бактерий оказалась значительно снижена, вместе с тем возрастала численность лактозонегативных энтеробактерий и бактерий со слабой лактозной активностью, выявлялись гемолитические штаммы E. coli.
К объективным критериям, свидетельствующим о нарушении экологического баланса в биотопе желудочно-кишечного тракта, следует отнести число и процентное соотношение патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, которые неприхотливы и достаточно быстро растут на обычных питательных средах. Количественный учет лактозанегативные энтеробактерий и бактерий со слабой лактозной активностью служит достоверным способом выявления дисбактериоза кишечника.
При этом следует иметь в виду, что в этиологии желудочно-кишеч-ных инфекций телят наиболее значимое место занимают представители родов Salmonella ,Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Morganella, Providencia. Дифференциация указанных возбудителей требует времени для выделения чистой культуры, а также проведения множества тестов. Для ускорения и стандартизации бактериологического анализа мы применяли дифференциальные среды нового поколения — хромогенные, принцип действия которых основан на выявлении высокоспецифичных ферментов микроорганизмов. В частности, при использовании среды Chro-mocult Coliform Agar («Merck», Германия) за счет наличия двух хромогенных субстратов можно в течение суток, выполнив 1-2 теста, выделить и одновременно идентифицировать бактерии.
Микроскопические исследования, помимо прикладного значения,  связаны с решением теоретических задач, так как позволяют раскрыть механизм экологической пластичности и адаптации микроорганизмов к длительной персистенции in vivo и in vitro. В этой связи мы изучали микроорганизмы на популяционном уровне с использованием методов щадящей фик-

А

  Б

Рис. 1. Конидиеносцы Aspergillus spp. (А) (оптическая микроскопия; окраска 1 % раствором осмиевой кислоты, увеличение x90) и фрагменты колоний Aspergillus spp. (Б) (сканирующая электронная микроскопия; увеличение x460) в образцах грубых кормов (ООО «Колхоз им. В.Г. Пряхина»,

Кораблинский р-н, Рязанская обл., 2009 год).

сации и обезвоживания объектов. Полученные препараты были достаточно контрастными, артефакты в них отсутствовали. Бактерии и грибы окрашивались в коричневый цвет, что позволяло с помощью лупы или оптического микроскопа подсчитать даже точечные колонии. Такие препараты можно хранить в музейных коллекциях в течение длительного времени.


Рис. 2. Фрагмент колонии Escherichiacoli, выделенной из кишечника телят при дисбактериозе (сканирующая электронная микроскопия; увеличение x460) (ООО «Колхоз им. В.Г. Пряхина», Кораблинский р-н, Рязанская обл., 2009 год).

Применение указанных методов давало возможность наблюдать за ростом и развитием популяций микроорганизмов в оптическом и сканирующем электронном микроскопе (рис. 1). Популяции многоклеточных колоний бактерий и грибов имели упорядоченное строение и дифференциацию клеток, зависящую от условий культивирования (рис. 2).
Способность клеток объединяться с помощью межклеточного матрикса, а также внутрипопуляционная изменчивость расширяют границы экологической пластичности возбудителей. Популяционная изменчивость обусловливает переход морфологически измененных форм микроорганизмов в так называемое некультивируемое состояние (11). В популяции клеток могут образовываться L-формы, которые невозможно выявить традиционными бактериологическими методами. Визуальное отсутствие роста культуры бактерий в этом случае не всегда свидетельствует о бактерицидном или фунгицидном действии химиотерапевтических препаратов.
Таким образом, для прижизненного определения количественного и качественного состава микрофлоры в кишечнике достаточно точным и легковыполнимым в практических условиях методом служит окраска карболовым фуксином по Циль-Нильсену, с помощью которой можно выявить и дифференцировать возбудителей болезней, относящихся к разным систематическим группам (бактерии, грибы, ооцисты простейших). При посмертной диагностике наиболее эффективен метод отпечатков, сохраняющий естественную архитектонику сочленов микробиоценоза желудочно-кишечного тракта. Использование хромогенных сред позволяет в течение суток выделить и идентифицировать соответствующие бактерии без проведения дополнительных тестов. Применение щадящих методов фиксации и обезвоживания объектов дает возможность наблюдать за процессами роста и развития популяций микроорганизмов как в естественных условиях, так и при воздействии неблагоприятных факторов.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. B a i n e s  D.,  M a s s o n  L.,  M c A l l i s t e r  T. A rapid, sensitive method for testing the activity of Escherichia coli 0157: H7 secreted cytotoxins against epithelial cells from the jejunum and descending colon of cattle. Canad. J. Аnim. Sci., 2008, 88(1): 51-55.
2. Т а р а к а н о в  Б.В. Физиолого-биохимическая характеристика антагонистических лактобацилл, выделенных из рубца телят. С.-х. биол., 1995, 6: 119-128.
3. С у б б о т и н  В.В. Биотехнология пробиотика лактобифадола (бифацидобактерина) и его лечебно-профилактическая эффективность. Автореф. докт. дис. М., 1999.
4. С к о р о д у м о в  Д.И.,  С у б б о т и н  В.В.,  С и д о р о в  М.А.,  К о с т е н к о  Т.С. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных. М., 2005.
5. К у л и к о в с к и й  А.В.,  К о с т и н  В.В.,  А й в а з я н  М.А. Методические рекомендации по диагностике и мерам борьбы с кандидамикозом сельскохозяйственных животных. М., 1991.
6. П а в л о в а  И.Б.,  Л е н ч е н к о  Е.М.,  Б а н н и к о в а  Д.А. Атлас морфологии популяций патогенных бактерий. М., 2007. 
7. ГОСТ 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб». М., 2009.
8. ГОСТ 18057-88 «Грубые корма. Метод выделения микроскопических грибов». М., 1988.
9. М а р и н и н  Е.А. Биометрическая обработка лабораторных, клинических и эпизоотологических данных. Новочеркасск, 1980.
10. З а р о з а  В.Г. Эшерихиоз телят. М., 1991.
11. C o l w e l l  R.R.,  B r a y t o n  P.R.,  G r i m e s  D.J.,  R o s z a k  D.B.,  H u q  S.A.,
12. P a l m e r  L.M. Viable but nonculturable Vibrio cholera and related pathogens in the environment implication for the release of genetically engineered microorganism. Biotechnology, 1985, 3: 817-820.    

 

METHODS OF DETERMINATION OF QUALITATIVE AND QUANTITATIVE COMPOSITION OF MICROORGANISMS DURING INTESTINE DYSBACTERIOSIS IN CALVES

A.V. Motorygin, E.M. Lenchenko

The authors consider the methods of estimation of qualitative and quantitative composition of populations of pathogenic and potentially pathogenic microorganisms during intestinal dysbacteriosis in the calves of the Holshein and Black-and-White breeds. The Ziehl-Nielsen method of carbolic fuchsin painting was recognized of the most effective for life-time diagnostics and the method of imprints and the use of chromogenic media — for postmortal diagnostics. It was established that the application of sparing methods of fixation and deaquation of objects permit to observe for growth and development of microorganisms.

Keywords: dysbacteriosis, calves, Еnterobacteriaceae, microscopy, nutrient mediums.

ГОУ ВПО Московский государственный
университет прикладной биотехнологии,

109316 г. Москва, ул. Талалихина, 33,
e-mail: hystology@yandex.ru   

Поступила в редакцию
24 ноября 2009 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало