УДК 636.52/.58:591.089.843
КРИОКОНСЕРВАЦИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЛАСТОДЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КУР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ХИМЕРНЫХ ОСОБЕЙ
Б.Е. СВИРИДОВ, И.Ш. ШАПИЕВ, Ю.В. СИЛИН
На породах кур черный австролорп, род айленд (доноры) и русская белая, белая бентамка (реципиенты) исследовали возможность криоконсервации и дальнейшей трансплантации плюропотентных бластодермальных клеток в эмбрионы. После криоконсервации и трансплантации получены цыплята с проявлением химеризма по окраске пера.
Ключевые слова: бластодермальные клетки, криоконсервация, химеризм.
Интенсивное развитие птицеводства с использованием узкоспециализированных линий и кроссов приводит к уменьшению генетического потенциала пород и линий сельскохозяйственной птицы. Криоконсервация плюропотентных эмбриональных клеток кур позволяет сохранить уникальные виды, а также использовать эти клетки при создании трансгенных особей. Метод криоконсервации сперматозоидов давно разработан и широко используется как в научных исследованиях, так и в практической работе. В то же время он не позволяет полностью реконструировать генетику отдельных видов, линий, кроссов. Замораживание яйцеклеток и оплодотворенных яиц по ряду причин (в частности, из-за большого размера) проблематично. В этой связи наиболее перспективной представляется криоконсервация бластодермальных плюропотентных клеток, а также первичных половых клеток, выделенных из кровеносного русла 2-суточных или из первичных гонад 5-суточных эмбрионов. Эмбриональные стволовые клетки плюропотентны и могут дифференцироваться в клетки различных тканей, включая ткани половых органов. Имеются сведения, что суспензия эмбриональных плюропотентных клеток может быть успешно заморожена, но эффективность трансплантации этих клеток в эмбрионы с целью получения мозаицизма по половым и соматическим клеткам остается довольно низкой (1-7). Замораживание каждого типа клеток происходит с разной результативностью (8).
Цель настоящей работы заключалась в подборе условий криоконсервации и последующей трансплантации бластодермальных плюропотентных клеток в эмбрионы кур для получения птицы, химерной по окраске пера.
Методика. Плюропотентные бластодермальные клетки были получены из эмбрионов на Х-стадии. В качестве доноров использовали яйца кур породы черный австролорп, род айленд. Реципиентами служили эмбрионы кур пород русская белая и белая бентамка. Выделенные эмбрионы отмывали от желтка модифицированной средой Дюльбекко (ДМЕМ), затем переносили в среду Дюльбекко, содержащую трипсин и ЭДТА («Биолот», Россия) (соответственно 0,13 и 0,2 %), затем инкубировали 5 мин при 37 °С, пипетировали пастеровской пипеткой и центрифугировали при 300 g в течении 3 мин. Осажденные клетки ресуспендировали в среде ДМЕМ, содержащей 10 % фетальной сыворотки (ФС) крупного рогатого скота («Sigma», США). Число бластодермальных клеток в суспензии определяли подсчетом в камере Горяева. В качестве среды замораживания использовали среду ДМЕМ с 10 % ФС с добавлением в качестве криопротектора 5 или 10 % диметилсульфоксида (ДМСО) («Sigma», США). Суспензию плюропотентных бластодермальных клеток помещали в пайетты объемом 0,25 мл и охлаждали со скоростью 0,3 °С/мин до +4 °С. Замораживание осуществляли при -110 °С с последующим переносом в жидкий азот. В каждой пайетте находилось 30-40 доз, что соответствовало 9-12 тыс. клеток.
Суспензию клеток размораживали при 37 °С и микропипеткой по 6-8 мкл переносили в подзародышевую область эмбриона реципиента на Х-стадии развития (в контрольном варианте использовали интактные бластодермальные клетки). Отверстие в скорлупе закрывали парафилмом. Яйца инкубировали в соответствии с общепринятой методикой.
Степень химеризма определяли по изменению окраски пера цыплят породы русская белая или белая бентамка.
Результаты. В результате трансплантации интактных бластодермальных клеток в эмбрионы кур выход цыплят составил 19,4 %, из которых 33,3 % были химерными по окраске пера. Криоконсервированные бластодермальные клетки пересадили в 132 эмбриона, в результате чего получили 28 цыплят, из которых 5 оказались химерными, то есть белые цыплята имели перья черного или красного цвета в зависимости от породы донора бластодермальных клеток. Выводимость цыплят при пересадке интактных и криоконсервированных клеток различалась незначительно, но выход химерных цыплят в результате криоконсервации трансплантируемых клеток снизился. При использовании криопротектора ДМСО в концентрации 5 % выход химерных цыплят составил 25 %, в концентрации 10 % — 16,6 %. В связи с тем, что было получено всего 18 химерных цыплят, говорить о преимуществе тех или иных пород в качестве доноров и реципиентов не представляется возможным.
| Выход химерных цыплят пород русская белая и белая бентамка при трансплантации в эмбрионы интактных и криоконсервированных бластодермальных клеток в зависимости от концентрации криопротектора | |||||
Концентрация диметилсульфоксида, % |
Число эмбрионов- |
Выход цыплят |
Получено химер |
||
всего, шт. |
доля, % |
всего, шт. |
доля, % |
||
И н т а к т н ы е б л а с т о д е р м а л ь н ы е к л е т к и |
|||||
0 |
201 |
39 |
19,4 |
13 |
30,1 |
К р и о к о н с е р в и р о в а н н ы е б л а с т о д е р м а л ь н ы е к л е т к и |
|||||
5 |
20 |
4 |
20,0 |
1 |
25,0 |
10 |
112 |
24 |
21,4 |
4 |
16,6 |
Согласно данным литературы (1-4, 8, 9), степень фенотипического химеризма составляет 11-43 %. Этот показатель в разных органах может быть различным (6). Большое значение для создания птицы с высокой степенью химеризма имеет количественное соотношение трансплантируемых плюропотентных клеток донора и таких же клеток реципиента. Уменьшение числа бластодермальных клеток у реципиента можно достичь при УФ-облучении, обработке эмбриона бисульфаном или конконавалином А, увеличение числа донорских клеток в реципиенте — за счет увеличения числа трансплантируемых клеток (7). Не исключено, что определенное влияние оказывают также индивидуальные свойства доноров и реципиентов.
Таким образом, предложены условия, при которых бластодермальные клетки, выделенные из эмбриона на Х-стадии развития, могут быть культивированы, заморожены и использованы для получения соматических, а также половых химер. Развитие биотехнологий криоконсервации, получения и трансплантации эмбриональных стволовых клеток позволяет не только значительно повысить эффективность работ по сохранению генофонда, но и создавать новые формы сельскохозяйственной птицы с заданными признаками.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Т е р е щ е н к о А.В., Т а г и р о в М.Т., Б е л е ц к а я А.В. и др. О возможности получения инъекционных химер кур. С.-х. биол., 1993, 2: 48-50.2. К а л ь ч е н к о Ю.В., Т е р е щ и н к о А.В. Совершенствование метода получения инъекционных химер. Птахiвництво, 2003, 53: 433-436.
3. M o o r e D.T., P u r d y P.H., B l a c k b o r n H.D. A method for cryopreserving chicken premordial germ cells. Poultry Sci., 2006, 85(10): 1784-1790.
4. N a i t o M., T a j i m a A., T a g a m i Y. е.а. Preservation chick primordial germ cells in liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring. J. Reprod. Fert., 1994, 102: 321-325.
5. P e t i t t e J.N., C l a r k M.E., L i u G. е.а. Productin of somatic and germline chimeres in the chicken by transfer of early blastodermal cells. Development, 1990, 108: 185-189.
6. P a r k T.S., H a n J.Y. Derivation and Characterization of pluropotent embryonic germ cells in chicken. Mol. Reprod. Develop., 2000, 56: 475-482.
7. N a i t o M. Development of avian embryo manipulation techniques and their application to germ cell manipulation. J. Animal Sci., 2003, 74: 157-168.
8. P e t i t t e J.N. Avian germplasm preservaton: embryonic stеm cells or primordial germ cells? Poultry Sci., 2006, 85(2): 237-242.
9. T a j i m a A., M i n e m a t s u T., O h a r a M. Production of germline chimeras by the transfer of cryopreserved gonadal germ cells collected from 7-9 day old chicken embryos. J. Animal Sci., 2004, 75: 85-88.
CRYOPRESERVATION AND THE USE OF BLASTODERMAL HEN CELLS FOR THE CREATION OF CHIMERAS
B.E. Sviridov, I.Sh. Shapiev, Yu.V. Silin
On the hens of the Black Australorp, Rhode Island breeds (donors) and the Russian White, White Bantam breed (recipients) the authors studied the possibility of cryopreservation and subse-quent transplantation of pluripotent blastodermal cells to embryos. It was shown that after cryopre-servation and transplantation the 21 % of chicken has chimerical plumage coloration.
Key words: blastodermal cells, cryopreservation, chimaera.
ГНУ Всероссийский НИИ генетики и |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
