doi: 10.15389/agrobiology.2023.1.87rus
УДК 631.52:581.557:575
Работа поддержана грантом РНФ 19-16-00081П.
БИОРАЗНООБРАЗИЕ СИМБИОЗОВ, ОБРАЗУЕМЫХ КЛУБЕНЬКОВЫМИ БАКТЕРИЯМИ Rhizobium eguminosarum C БОБОВЫМИ РАСТЕНИЯМИ ГАЛЕГОИДНОГО КОМПЛЕКСА
О.П. ОНИЩУК1, О.Н. КУРЧАК1, А.К. КИМЕКЛИС1, Т.С. АКСЕНОВА1,
Е.Е. АНДРОНОВ1, 2, Н.А. ПРОВОРОВ1 ✉
Клубеньковые бактерии вида Rhizobium leguminosarum разделяют на два биовара (bv.), которые образуют N2-фиксирующие симбиозы с бобовыми растениями галегоидного комплекса, относящимися к трибам Fabeae (роды Lathyrus, Lens, Pisum, Vavilovia, Vicia, симбионт — R. leguminosarum bv. viciae) и Trifolieae (род Trifolium, симбионт — R. leguminosarum bv. trifolii) (J. Sprent с соавт., 2017). Ранее считалось, что перекрестная инокуляция между этими биоварами отсутствует или происходит редко, а сведения о контроле хозяйской специфичности R. leguminosarum были ограничены взаимодействием между линиями гороха (P. sativum), имеющими разные аллели гена Sym2, и штаммами bv. viciae, различающимися по наличию гена nodX (T.A. Lie, 1978). В настоящей работе впервые показано, что при переходе штаммов bv. viciae к симбиозу с эволюционно молодыми представителями трибы Fabeae (переход от А- к D-группе) происходит утрата бактериями способности формировать симбиоз с гетерологичным хозяином (Trifolium). Целью нашей работы был анализ изменчивости штаммов R. leguminosarumbv. viciae анцестральной (A) и эволюционно продвинутой (D) геномных групп по хозяйской специфичности и N2-фиксирующей активности, направленный на функциональную характеристику анцестральных элементов генома, которые были выявлены ранее при сравнительно-генетическом анализе штаммов, выделенных из различающихся по филогенетическому положению представителей трибы Fabeae. В соответствии с ранее предложенной методикой генотипирования штаммы относили к группе А в том случае, если они содержали гены nodX и fixW, не содержали хромосомной копии оперона fixNOPQ, а ген nodT находился за пределами nod-кластера. При отсутствии хотя бы одного из этих признаков штаммы относили к группе D (E. Chirak с соавт., 2019). Штаммы группы А выделены из реликтового бобового Vavilovia formosa, а также из дикорастущих афганских линий P. sativum, штаммы группы D — из культурных европейских линий P. sativum, а также из Vicia sativa и V. alpestris. В опытах по анализу перекрестной инокуляции двух биоваров вида R. leguminosarum использовали штаммы bv. viciae, выделенные из клубеньков Vavilovia formosa, Vicia sativa, V. subrotunda, европейских линий Pisum sativum, афганских линий P. sativum, а также штаммы bv. trifolii из клубеньков клевера (Trifolium pratense, T. ambiguum, T. montanum). При проведении микровегетационных опытов растения, инокулированные ризобиями, выращивали в гнотобиотических условиях на вермикулите. N2-фиксирующую активность определяли с помощью ацетиленового метода, основанного на использовании C2H2 в качестве субстрата для нитрогеназы. На основании полученных результатов были выявлены следующие симбиотические фенотипы: Fix+ — N2-фиксирующие (крупные, розовые) клубеньки; Fix- — не фиксирующие N2 (мелкие, белые, но морфологически нормальные) клубеньки; Fix+/- — не фиксирующие N2 клубеньки, сходные с Fix+ клубеньками (крупные, розовые); Ndv- — не фиксирующие N2, опухолеподобные клубеньки; Nod- — клубеньки отсутствовали. Оказалось, что 9 из 11 штаммов анцестральной группы образовали на клевере клубеньки фенотипа Fix-, 2 штамма — клубеньки фенотипа Ndv-. Среди 8 штаммов эволюционно продвинутой группы фенотипы Fix- и Ndv- выявлены соответственно у 4 и 2 штаммов, а 2 штамма не образовали на клевере клубеньков (Nod-), что указывало на сужение хозяйской специфичности ризобий в процессе коэволюции bv. viciae с растениями-хозяевами. Среди 6 штаммов ризобий клевера 4 штамма проявили способность к инокуляции вики с образованием Fix- клубеньков. В опытах по контролю за отсутствием контаминации ДНК выделяли из клубеньков с использованием набора NucleoSpinÔ Soil («Macherey-Nagel GmbH & Co. KG», Германия), фрагмент гена nodA амплифицировали с использованием универсальных праймеров для биоваров R. leguminosarum (ndARL302_F YTDGGMATCGCHCACT/ndARL518_R RDACGAGBACRTCTTCRGT). Полученные данные показали, что в условиях стерильных микровегетационных опытов контаминация отсутствует и способность к перекрестной инокуляции проявляет большинство штаммов bv. viciae (образуют клубеньки на клевере) и bv. trifolii (образуют клубеньки на вике). Однако эта способность ограничена формированием у гетерологичных хозяев не фиксирующих N2, в том числе аномальных по морфологии (опухолеподобных), клубеньков. Изучение симбиозов, образуемых 9 видами растений трибы Fabeae (Pisum sativum, Vicia sativa, V. villosa, V. alpestris, Vavilovia formosa, Lens culinaris, L. nigricans, Lathyrus pratensis, L. sylvestris) с 6 штаммами R. leguminosarum bv. viciae, показало высокую специфичность образования N2-фиксирующего симбиоза, которая зависит главным образом от происхождения бактерий. Штаммы, выделенные из одного и того же растения-хозяина (V. formosa или P. sativum), оказались более сходными по хозяйской специфичности, чем штаммы из разных хозяев. На основе полученных данных предложена гипотетическая схема эволюции вида R. leguminosarum, в соответствии с которой дивергентная эволюция bv. viciae определяется процессами видообразования, происходящего в трибе Fabeae; наиболее близким к общему предку вида R. leguminosarum является bv. trifolii, сохранивший примитивные черты организации генома и, возможно, возникший посредством изменения хозяйской специфичности у анцестральных штаммов bv. viciae. Их близкими родичами могут считаться штаммы bv. viciae, выделенные из вавиловии, которые в большей (по сравнению со штаммами из гороха и вики) степени проявляют способность формировать на клевере морфологически нормальные клубеньки. Полученные данные показывают возможность конструирования штаммов ризобий, обладающих повышенной симбиотической активностью, посредством редактирования анцестральных компонентов их геномов.
Ключевые слова: клубеньковые бактерии, бобовые растения, симбиотическая N2-фиксация, хозяйская специфичность, биоразнообразие, Rhizobium leguminosarum, геномные группы, эволюция симбиоза.
O.P. Onischuk1, O.N. Kurchak1, A.K. Kimeklis1, T.S. Aksenova1,
E.E. Andronov1, 2, N.A. Provorov1 ✉
Nodule bacteria of the species Rhizobium leguminosarum are differentiated into two biovars (bv.) that form N2-fixing symbioses with leguminous plants of the galegoid complex, tribes Fabeae (genera Lathyrus, Lens, Pisum, Vavilovia, Vicia, symbiont — R. leguminosarum bv. viciae) and Trifolieae (genus Trifolium, symbiont — R. leguminosarum bv. trifolii) (J. Sprent et al., 2017). It was previously assumed that cross-inoculation between these biovars is impossible or rare, while data on the control of host specificity of R. leguminosarum were limited by interactions between pea (P. sativum) lines with different alleles of Sym2 gene and bv. viciae strains that differ in the presence of nodX gene (T.A. Lie, 1978). The aim of our work was to analyze the variability of R. leguminosarum bv. viciae strains from ancestral (A) and evolutionarily advanced (D) genomic groups in terms of host specificity and N2-fixing activity, aimed at the functional characterization of ancestral genome elements, which were previously identified by the comparative genetic analysis of strains isolated from representatives of the Fabeae tribe that differ in phylogenetic affiliation. In accordance with the previously proposed genotyping technique, strains were assigned to group A if they contained the nodX and fixW genes, did not contain a chromosomal copy of the fixNOPQ operon, and the nodT gene was outside the nod cluster. In the absence of at least one of these features, the strains were assigned to group D (E. Chirak et al., 2019). Group A strains were isolated from the relict legume Vavilovia formosa and from wild-growing Afghan lines of P. sativum, group D strains were isolated from cultivated European lines of P. sativum, from Vicia sativa and V. alpestris. In experiments on the analysis of cross-inoculation of two R. leguminosarum biovars we used bv. viciae strains isolated from nodules of Vavilovia formosa, Vicia sativa, V. subrotunda, European lines of Pisum sativum, Afghan lines of P. sativum, as well as bv. trifolii strains from clover (Trifolium pratense, T. ambiguum, T. montanum) nodules. In microvegetative experiments, plants inoculated with rhizobia were grown under gnotobiotic conditions on vermiculite. N2-fixing activity was determined using the acetylene method based on the use of C2H2 as a substrate for nitrogenase. Based on the results obtained, the following symbiotic phenotypes were identified: Fix+ — N2-fixing (large, pink) nodules; Fix- — non-fixing N2 (small, white, but morphologically normal) nodules; Fix+/-— nodules not fixing N2, but similar to Fix+ nodules (large, pink); Ndv- — non-fixing N2, tumor-like nodules; Nod- — nodules were absent. It turned out that 9 out of 11 strains of the ancestral group formed on clover nodules of Fix- phenotype, and 2 strains formed nodules of Ndv- phenotype. Among 8 strains of the evolutionarily advanced group, the Fix- and Ndv- phenotypes were detected in 4 and 2 strains, respectively, and 2 strains did not form nodules on clover (Nod-), indicating a narrowing of the host specificity of rhizobia during coevolution of bv. viciae with host plants. Therefore, we have shown for the first time that during the transition of bv. viciae strains to symbiosis with evolutionarily young representatives of the tribe Fabeae (transition from the A- to the D-group), bacteria lose the ability to form symbiosis with a heterologous host (Trifolium). Among 6 strains of clover rhizobia, 4 strains showed the ability to inoculate vetch forming Fix- nodules. In experiments to control the absence of contamination, DNA was isolated from nodules using the NucleoSpinÔ Soil (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany), the nodA gene fragment was amplified using universal primers for R. leguminosarum biovars (ndARL302_F YTDGGMATCGC-HCACT/ndARL518_R RDACGAGBACRTCTTCRGT). The data obtained showed that under the conditions of sterile microvegetation experiments there is no contamination and the majority of strains are able for cross-inoculation: bv. viciae strains form nodules on clover and bv. trifolii form nodules on vetch. However, this ability is limited by the formation of non-fixing N2 nodules in heterologous hosts, including morphologically abnormal (tumor-like) nodules. The study of symbioses formed by 9 species of leguminous plants of tribe Fabeae (Pisum sativum, Vicia sativa, V. villosa, V. alpestris, Vavilovia formosa, Lens culinaris, L. nigricans, Lathyrus pratensis, L. sylvestris) with 6 R. leguminosarum bv. viciae strains, demonstrated a pronounced specificity of N2-fixing symbiosis formation, which depends mostly on the bacteria origin. Strains isolated from the same legume species (V. formosa or P. sativum) are more similar in host specificity than strains from different hosts. A hypothetical scheme of R. leguminosarum evolution is proposed, according to which: a) divergent evolution of bv. viciae is determined by host plant speciation in tribe Fabeae; b) the closest relative of a common ancestor of R. leguminosarum is represented by bv. trifolii, which display an evolutionary primitive sym gene organization and possibly originated from the ancestral bv. viciae strains that changed their host specificity. The rhizobia isolated from V. formosa may be considered as the close relatives of these ancestral strains since they exceed the pea and vetch isolates in the ability to form morphologically normal nodules with the heterologous host, clover. The data obtained show the possibility of constructing rhizobia strains with an increased symbiotic activity by editing the ancestral components of their genomes.
Keywords: nodule bacteria, leguminous plants, symbiotic N2-fixation, host specificity, biodiversity, Rhizobium leguminosarum, genomic groups, evolution of symbiosis.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной |
Поступила в редакцию |
