БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ
ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ
 
КАК ПОДАТЬ РУКОПИСЬ
 
КАРТА САЙТА
НА ГЛАВНУЮ

 

 

 

 

doi: 10.15389/agrobiology.2020.1.128rus

УДК 634.71:57.085.23

Работа выполнялась при поддержке РФФИ (проект № 18-416-440002 р_а).

 

ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ Rubus arcticus L.
МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ МИКРОСПОР in vitro

Д.Н. ЗОНТИКОВ1, С.А. ЗОНТИКОВА1, К.В. МАЛАХОВА1,
Э.В. МАРАМОХИН1, А.В. ПОЛЯКОВ2, Р.В. СЕРГЕЕВ3

Княженика арктическая (Rubus arcticus L.) — ценная ягодная культура, которая используется в качестве плантационной культуры относительно короткое время. Княженика арктическая служит донором ремонтантности при межвидовой гибридизации с Rubus idaeus L., однако передает потомству низкую урожайность. Основное направление селекции R. arcticus — повышение урожайности растений, в связи с чем особое значение имеет ускорение селекционного процесса. Добиться этого можно, используя растения с удвоенным гаплоидным набором хромосом. В настоящей работе нами впервые были получены гаплоидные растения-регенеранты R. arcticus в культуре микроспор, подобрана концентрация 6-бензиламинопурина и источник углеводного питания для индукции эмбриоидогенеза. Цель нашего исследования состояла в разработке методики получения гаплоидных растений Rubus arcticus в культуре микроспор. В опытах использовали сорта княженики арктической, выведенные селекционерами в Финляндии (Pima, Mespi) и Швеции (Astra). Для получения донорных эксплантов в течение всего года применяли метод выгонки генеративных побегов. Микроспоры из пыльников выделяли при помощи ручного гомогенизатора в микропробирки типа Эппендорф (1,5 мл), добавляли 0,5 мл стерильной воды с глюкозой в концентрации 30 г/л, центрифугировали при скорости 4500 об/мин и микродозатором переносили на питательные среды для активации морфогенеза. Для изоляции пыльников с последующим выделением микроспор использовали бутоны длиной от 90 до 120 мм за 4-5 сут до начала распускания цветка. Плотность микроспор в суспензии составляла около 40000 шт. в 0,5 мл стерильного водного раствора с глюкозой. Для получения такой плотности измельчали 60 пыльников. Для индукции эмбриоидогенеза микроспоры культивировали на среде Мурасиге-Скуга (МС), обогащенной 6-бензиламинопурином (6-БАП) в концентрациях от 0,50 до 2,00 мг/л. После появления эмбриоидов использовали среду MС с содержанием макро- и микроэлементов в полной концентрации и уменьшенной до 75 и 50 % по прописи. Также исследовали влияние на рост и развитие эмбриоидов источника углеводного питания. Для этого использовали глюкозу, сахарозу и мальтозу в концентрациях 20, 30 и 40 г/л. В начале эксперимента подсчитывали число микроспор в пыльниках и определяли соотношение стадий развития микроспоры с длиной бутонов. При числе пыльников у R. arcticus от 70 до 86 и длине бутона от 1,0 до 1,4 мм, число зрелых пыльцевых зерен составляло от 590 до 710 шт. в одном пыльнике. Мы выделили четыре основные стадии развития микроспоры: тетрада; невакуолизированная микроспора с центральным локализованным расположения ядра; сильно вакуолизированная микроспора с утолщенной стенкой, крупной вакуолью и небольшим ядром, расположенным латерально; трехклеточная пыльца. На среде, содержащей 6-БАП в концентрации 1,5 мг/л, эмбриоиды визуализировались на 51±2-е сут культивирования, а их число достигало 23±3 шт. Установлено влияние концентрации маточного раствора питательной среды и источника углеводного питания на рост эмбриоидов. Лучшие морфометрические показатели эмбриоидов получили в варианте с концентрацией макроэлементов по прописи МС 0,75 и глюкозой в концентрации 30 г/л. В этом варианте рост эмбриоидов отмечали на 12±2-е сут, появление листочков — на 44±1-е сут, а на 40-е сут культивирования длина эмбриоидов достигала 5±0,2 мм. Для контроля плоидности полученных растений-регенерантов использовали прямой метод подсчета хромосом и косвенный — подсчет хлоропластов в замыкающих клетках устьиц. В результате подсчета был подтвержден гаплоидный набор хромосом полученных растений-регенерантов (n = 7). Результаты исследования позволяют использовать предложенный метод при получении гаплоидных растений R. arcticus, которые после удвоения хромосомного набора могут быть включены  в селекционный процесс.

Ключевые слова: Rubus arcticus, гаплоид, диплоид, культура микроспор, эмбриоид, морфогенез, растение-регенерант.

 

 

GENERATION OF Rubus arcticus L. HAPLOIDS
THROUGH in vitro MICROSPORE CULTURE TECHNIQUE

D.N. Zontikov1, S.A. Zontikova1, K.V. Malahova1, E.V. Maramohin1,
A.V. Poliykov2, R.V. Sergeev3

Arctic raspberry (Rubus arcticus L.) is a valuable small-fruit crop used as a plantation crop for a relatively short time. R. arcticus is a remontant donor in interspecific hybridization with Rubus idaeus L., though conditioning low yields to hybrids. So R. arcticus is primarily bred for yield enhancement; therefor, the acceleration of the breeding process is of great importance. This can be achieved using plants with a doubled haploid set of chromosomes. This paper is the first to describe the technique of production haploid plants of R. arcticus via in vitro microspore culture. In the experiments we used Finnish cultivars Pima and Mespi and Swedish cultivar Astra. To obtain donor explants, the method of forcing generative shoots was used throughout the year. Microspores were isolated from anthers with the use of manual homogenizer into a 1.5 ml micro test Eppendorf tube. The homogenate was added with 0.5 ml sterile water containing 30 g/l glucose, centrifuged at 4500 rpm, and the microspores were transferred with a microdoser to nutrient medium for morphogenesis initiation. To obtain microspores, the anthers were isolated from buds of 90 to 120 mm long 4-5 days before the flower bloomed. The concentration of the microspores in the suspension was about 40,000 per 0.5 ml sterile aqueous solution with glucose; for this, 60 anthers were crushed. To induce embryoidogenesis, we used the Murashige and Skoog (MS) plant growth medium supplemented with 0.50 to 2.00 mg/l growth regulator 6-benzylaminopurine (6-BAP). After the appearance of embryoids, we used MS, 75 % MS, or 50 % MS growth media, and also the effect of carbohydrate sources, i.e. glucose, sucrose and maltose at a 20, 30 and 40 g/l dosage, was investigated. We have identified the following microspore development stages: tetrads, non-vacuolated microspore, strongly vacuolated microspore, three-cell pollen. It was found that MS nutrient media containing 1.5 mg/l6-BAP provides for 23±3 embryoids on day 51±2 of culture. We have also found the effect of MS concentration and the source of carbohydrate nutrition on the growth of embryoids. The combination of 0.75 MS and 30 g/l glucose was the most effective leading to embryoid growth on day 12±2 and the appearance of leaflets on day 44±1. On day 40 of culture the embryoids reached 5±0.2 mm in length. The ploidy control of regenerant plants, by counting chromosomes and chloroplasts in the stomata guard cells, confirmed the haploid set of chromosomes (n = 7). These findings allow the use of the proposed technique to generate R. arcticus haploids which, after doubling the chromosome set, may be involved in breeding.

Keywords: Rubus arcticus, haploid, diploid, microspore culture, embryoid, morphogenesis, regenerant plant.

 

1ФГБОУ ВО Костромской государственный университет,
156005 Россия, г. Кострома, ул. Дзержинского, 17,
e-mail: info@kstu.edu.ru, zontikovdn@mail.ru ✉, antennaria@mail.ru,maramokhin91@mail.ru, malakhova.kv1@gmail.com;
2Всероссийский НИИ овощеводства —
филиал ФГБНУ Федеральный научный центр овощеводства,
140153 Россия, Московская обл., Раменский р-н, д. Верея, стр. 500,
e-mail: vita100plus@yandex.ru;
3ФГБОУ ВО Поволжский государственный
технологический университет,

424000 Россия, Республика Марий Эл, г. Йошкар-Ола, пл. Ленина, 3, e-mail: info@volgatech.net, rsergeyev@yahoo.com

Поступила в редакцию
25 марта 2019 года

 

назад в начало

 


СОДЕРЖАНИЕ

 

 

Полный текст PDF

Полный текст HTML