ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ Rubus arcticus L.МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ МИКРОСПОР in vitro

Княженика арктическая (Rubus arcticus L.) — ценная ягодная культура, которая используется в качестве плантационной культуры относительно короткое время. Княженика арктическая служит донором ремонтантности при межвидовой гибридизации с Rubus idaeus L., однако передает потомству низкую урожайность. Основное направление селекции R. arcticus — повышение урожайности растений, в связи с чем особое значение имеет ускорение селекционного процесса. Добиться этого можно, используя растения с удвоенным гаплоидным набором хромосом. В настоящей работе нами впервые были получены гаплоидные растения-регенеранты R. arcticus в культуре микроспор, подобрана концентрация 6-бензиламинопурина и источник углеводного питания для индукции эмбриоидогенеза. Цель нашего исследования состояла в разработке методики получения гаплоидных растений Rubus arcticus в культуре микроспор. В опытах использовали сорта княженики арктической, выведенные селекционерами в Финляндии (Pima, Mespi) и Швеции (Astra). Для получения донорных эксплантов в течение всего года применяли метод выгонки генеративных побегов. Микроспоры из пыльников выделяли при помощи ручного гомогенизатора в микропробирки типа Эппендорф (1,5 мл), добавляли 0,5 мл стерильной воды с глюкозой в концентрации 30 г/л, центрифугировали при скорости 4500 об/мин и микродозатором переносили на питательные среды для активации морфогенеза. Для изоляции пыльников с последующим выделением микроспор использовали бутоны длиной от 90 до 120 мм за 4-5 сут до начала распускания цветка. Плотность микроспор в суспензии составляла около 40000 шт. в 0,5 мл стерильного водного раствора с глюкозой. Для получения такой плотности измельчали 60 пыльников. Для индукции эмбриоидогенеза микроспоры культивировали на среде Мурасиге-Скуга (МС), обогащенной 6-бензиламинопурином (6-БАП) в концентрациях от 0,50 до 2,00 мг/л. После появления эмбриоидов использовали среду MС с содержанием макро- и микроэлементов в полной концентрации и уменьшенной до 75 и 50 % по прописи. Также исследовали влияние на рост и развитие эмбриоидов источника углеводного питания. Для этого использовали глюкозу, сахарозу и мальтозу в концентрациях 20, 30 и 40 г/л. В начале эксперимента подсчитывали число микроспор в пыльниках и определяли соотношение стадий развития микроспоры с длиной бутонов. При числе пыльников у R. arcticus от 70 до 86 и длине бутона от 1,0 до 1,4 мм, число зрелых пыльцевых зерен составляло от 590 до 710 шт. в одном пыльнике. Мы выделили четыре основные стадии развития микроспоры: тетрада; невакуолизированная микроспора с центральным локализованным расположения ядра; сильно вакуолизированная микроспора с утолщенной стенкой, крупной вакуолью и небольшим ядром, расположенным латерально; трехклеточная пыльца. На среде, содержащей 6-БАП в концентрации 1,5 мг/л, эмбриоиды визуализировались на 51±2-е сут культивирования, а их число достигало 23±3 шт. Установлено влияние концентрации маточного раствора питательной среды и источника углеводного питания на рост эмбриоидов. Лучшие морфометрические показатели эмбриоидов получили в варианте с концентрацией макроэлементов по прописи МС 0,75 и глюкозой в концентрации 30 г/л. В этом варианте рост эмбриоидов отмечали на 12±2-е сут, появление листочков — на 44±1-е сут, а на 40-е сут культивирования длина эмбриоидов достигала 5±0,2 мм. Для контроля плоидности полученных растений-регенерантов использовали прямой метод подсчета хромосом и косвенный — подсчет хлоропластов в замыкающих клетках устьиц. В результате подсчета был подтвержден гаплоидный набор хромосом полученных растений-регенерантов (n = 7). Результаты исследования позволяют использовать предложенный метод при получении гаплоидных растений R. arcticus, которые после удвоения хромосомного набора могут быть включены  в селекционный процесс.

Ключевые слова: Rubus arcticus, гаплоид, диплоид, культура микроспор, эмбриоид, морфогенез, растение-регенерант.

Княженика арктическая (Rubus arcticus L.) относится к ценным ягодным растениям. Несмотря на относительно небольшой срок ее использования в качестве плантационной культуры, получено несколько высокопродуктивных сортов. Княженика арктическая служит донором ремонтантности и отличных вкусовых качеств при межвидовой гибридизации с Rubus idaeus L., однако передает потомству низкую урожайность. Основное направление селекции R. arcticus — повышение урожайности растений, в связи с чем ускорение селекционного процесса и использование гаплоидов для селекции перекрестноопыляемых растений имеет особое значение (1-3). Применение технологии удвоенных гаплоидов позволяет преодолеть ряд селекционных трудностей. Гомозиготные линии на основе гаплоидов могут быть получены за 2-3 года (4). При этом, по мнению ряда исследователей, использование андроклинных регенерантов — единственный способ сохранить гетерозисный эффект ценной гибридной линии (5).

Работы, посвященные проблеме получения гаплоидных растений, объединяет общий план построения опытов: воздействие повышенными и/или пониженными температурами, химическая обработка донорных растений, изменение состава питательной среды (регуляторов роста, углеводных составляющих), подбор возрастной стадии развития пыльника и микроспоры. К настоящему времени опубликованы методики получения гаплоидных растений пшеницы (5, 6)), капусты (7-9), рапса (10), риса (11), моркови (12-14). Работы, посвященные получению гаплоидных растений R. arcticus L. в культуре микроспор, отсутствуют.

Факторов, влияющих на активизацию процессов переключения микроспор с гаметофитного пути развития на спорофитный, очень много, например, влияние видов и концентраций регуляторов роста (15-17), источников углеводного питания (18-20).

Ранее нами были предложены методические подходы для клонального микроразмножения R. arcticus (21). В развитие этих исследований в настоящей работе мы впервые получили гаплоидные растения-регенеранты R. arcticus в культуре микроспор, оптимизировав концентрацию 6-бензиламинопурина и источник углеводного питания для индукции эмбриоидогенеза.

Нашей целью была разработке методики получения гаплоидных растений Rubus arcticus L. в культуре микроспор.

Методика. Исследования проводили в 2018 году. Использовали сорта княженики арктической Пима (Pima), Меспи (Mespi), выведенные в Финляндии, и Астра (Astra) из Швеции. Микроспоры выделяли из пыльников, которые отбирали из бутонов разного возраста и размера.

Для снижения контаминации при введении в культуру in vitro и возможности круглогодичного получения бутонов использовали метод выгонки (22), при котором растения, высаженные в горшки, после завершения цветения инкубировали в течение 30 сут при температуре 4 °С. После холодовой обработки такие растения снова образовывали генеративные побеги.

Стерилизацию бутонов проводили по схеме: 1 мин в 70 % водном растворе этанола, 15 мин в 5 % водном растворе гипохлорита натрия или калия, затем их промывали в стерильной дистиллированной воде не менее трех раз. Выделенные пыльники собирали в микропробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл по 60 шт. и измельчали с помощью ручного гомогенизатора, одноканальным микродозатором Proline 20-200 («Sartorius Proline», Финляндия) добавляли 0,5 мл стерильной воды с глюкозой в концентрации 30 г/л. После этого пробирки центрифугировали (мини-центрифуга-вортекс Microspin FV-2400, SIA «BioSan», Латвия) 15 с при 4500 об/мин. Из каждой пробирки микродозатором переносили суспензию с микроспорами в культуральный сосуд объемом 10 мл (суспензию из одной пробирки помещали в один культуральный сосуд). Плотность суспензии составляла примерно 80000 микроспор/мл. Для изоляции пыльников с последующим выделением микроспор использовали бутоны длиной от 9 до 12 мм за 4-5 сут до начала распускания.

На каждом этапе in vitro культивирования микроспор менялся состав питательной среды и используемых регуляторов роста. При введении в культуру in vitro для активации морфогенеза использовали питательную среду Мурасиге-Скуга (MС) (23), дополненную 100 мг/л мезоинозита, 2 мг/л глицина, 0,5 мг/л тиамина, 0,5 мг/л пиридоксина, 30 г/л глюкозы и 5,0 г/л агара, рН от 5,8. В качестве регулятора роста использовали 6-бен-зиламинопурин (6-БАП) в концентрации от 0,50 до 2,00 мг/л («AppliChem GmbH», Германия). После появления эмбриоидов использовали среду MС («AppliChem GmbH», Германия) с содержанием макро- и микроэлементов в полной концентрации и в уменьшенной до 75 и 50 % по прописи (23). При исследовании влияние источника углеводного питания на рост и развитие эмбриоидов использовали глюкозу, сахарозу и мальтозу в концентрациях 20, 30 и 40 г/л.

Микроспоры, эмбриоиды и растения-регенеранты выращивали при освещенности 1500 лк, фотопериоде 16 ч (день)/8 ч (ночь) и температуре около 25 °С. На этапе введения в культуру in vitro, роста и развития эмбриоидов использовали стеклянные культуральные сосуды объемом 10 мл, на этапе роста растений-регенерантов — культуральные сосуды объемом 100 мл.

Хромосомы подсчитывали в меристемной зоне корня растений-регенерантов. Корни помещали в фиксатор Карнуа (24) и выдерживали в течение 24 ч. Затем промывали в течение 20 мин под проточной водой, помещали в смесь ферментов (0,3 % пектиназы, 0,3 % мацеразы, 0,3 % целюлазы + цитратный буфер) и инкубировали в течение 2 ч при температуре 37 °С. После этого корни на 3 мин помещали в 60 % уксусную кислоту, где материал измельчали препаровальной иглой, обводили фиксатором 3:1, встряхивали, промывали в абсолютном спирте, подсушивали, окрашивали метиленовым синим, промывали в дистиллированной воде и подсчитывали число хромосом (24) (световой микроскоп Биомед-3, «Биомед», Россия). Для подсчета числа хлоропластов использовали высечки из листьев диаметром 5 мм, с каждого растения делали по 5 высечек. Высечки окрашивали йодным красителем. Растущие в культуре in vitro растения-регенеранты фотографировали цифровой камерой Samsung NX-10 («Samsung», Южная Корея).

Экспериментальные данные представлены в виде средних арифметических значений (М) с указанием ошибки среднего (±SEM) и коэффициента вариации (Cv). Расчет доверительного интервала на основании t-распределения Стьюдента при уровне значимости р £ 0,05 проводили с использованием статистического пакета программы Microsoft Excel 2010.

Результаты. В начале эксперимента подсчитывали число микроспор в пыльниках и сопоставляли стадии развития микроспоры с длиной бутонов. При числе пыльников у R. arcticus от 70 до 86 шт. и длине бутона от 1,0 до 1,4 мм количество зрелой пыльцы в одном пыльнике составляло от 590 до 710 шт. Мы выделили четыре основных стадии развития микроспоры (рис. 1): 1-я стадия — тетрада (в бутонах длиной от 4 до 5 мм); 2-я стадия — невакуолизированная микроспора с центральным локализованным расположения ядра (в бутонах от 5 до 7 мм); 3-я стадия — сильно вакуолизированная микроспора с утолщенной стенкой, крупной вакуолью и небольшим ядром, расположенным латерально (в бутонах от 7 до 8 мм); 4-я стадия — трехклеточная пыльца (в бутонах длиной более 8 мм) (рис. 1).

Наибольшее число образовавшихся эмбриоидов на 50-53 сут культивирования было достоверно больше во всех сортах на среде, содержащей 6-БАП в концентрации 1,5 мг/л (табл. 1). Визуально эмбриоиды обнаруживали, начиная со стадии «сердечко», когда их размер достигал 0,5 мм. Достоверного влияния генотипа на морфогенез микроспор в культуре in vitro мы не выявили. Специального изучения влияния стадии развития микроспоры на морфогенетическую активность мы не проводили. Необходимо отметить только то, что микроспоры, которые помещали на питательную среду, в подавляющем большинстве находились на стадии вакуолизации.
В исследованиях для индукции эмбриогенеза и получения вторичных эмбриоидов активно используются разные концентрации 6-БАП в качестве регулятора роста (25). В нашей работе 6-БАП индуцировал прямой эмбриоидогенез.

Нами также установлено, что более интенсивные ростовые процессы происходили на питательной среде с содержанием макро- и мик-роэлементов, уменьшенным до 75 %, при концентрации глюкозы 30 г/л. В этом варианте рост эмбриоидов отмечали на 12-е сут культивирования, что достоверно отличалось от других вариантов. На 40-е сут их размер достигал 5 мм (рис. 2). Однако наименьшая гибель эмбриоидов наблюдалась на среде с полным составом макро- и микроэлементов (табл. 2).

Многие авторы отмечают положительное влияние повышенного осмотического давления, которое создается при концентрациях сахарозы от 10 до 17 %, на появление эмбриоидов (26-28), однако в наших опытах эмбриоидогенез у R. arcticus активно происходил при концентрации 3 %, а уже при 4 % скорость развития уменьшалась. Такое расхождение в результатах может объясняется тем, что мы изучали этап перехода от стадии эмбриоида к растению-регенеранту, а не этап образования эмбриоида из микроспоры.

Плоидность растений-регенерантов определяли подсчетом числа хромосом и числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (рис. 3). Варьирование по числу хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у диплоидных растений составляло от 8 до 12 шт., у гаплоидных — от 2 до 6 шт. Возможность использования косвенного метода для подтверждения плоидности доказана в ряде работ (29-31).

Проведенные исследования не позволяют идентифицировать, на какой именно стадии развития микроспоры лучше получать гаплоидные растения княженики, однако это имеет важное значение для определения факторов, влияющих на переключение программы развития микроспоры с гаметофитной на спорофитную (17, 19, 28, 32). Можно только отметить, что большая часть микроспор находилась на стадии вакуолизации. Одним из основных факторов переключения на спорофитный путь развития у микроспор княженики было использование регулятора роста 6-бензил-аминопурина и глюкозы в качестве источника углеводного питания. Критически важным моментом при получении гаплоидных растений становится не только получение эмбриоидов, но и сохранение их жизнеспособности и морфогенетической активности при переносе на свежую питательную среду (33). Согласно нашим результатам, для его успешного прохождения необходимо снижение концентрации макро- и микроэлементов в питательной среде до 75 %, тогда как уменьшение до 50 % приводит к снижению жизнеспособности.

Таким образом, для получения гаплоидных растений-регенерантов Rubus arcticus L. сортов Pims, Mespi и Astra целесообразно использовать питательную среду Мурасиге-Скуга, обогащенную 6-бензиламинопурином в концентрации 1,5 мг/л, что дает выход от 18±1 до 23±3 эмбриоидов на 40000 микроспор. Для получения растений-регенерантов из эмбриоидов необходимо использовать среду Мурасиге-Скуга с уменьшенным до 75 % содержанием макро- и микроэлементов, глюкозу в концентрации 30-40 г/л, 6-бензиламинопурин — 1,5 мг/л, что позволяет индуцировать рост эмбриоидов за самое короткое время культивирования, а к 40-м сут получить эмбриоиды длиной 5±0,2 мм. Результаты выполненного исследования и предложенная нами методика могут использоваться при создании удвоенных гаплоидов других сортов R. arcticus для включении в селекционно-генетические программы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Тяк Г.В. Применение минеральных удобрений в посадках княженики на выработанном торфянике. Мат. Межд. науч.-практ. конф. «Теоретические и прикладные аспекты рационального использования и воспроизводства недревесной продукции леса». Гомель, 2008: 305-308.
2. Karp K., Starast M. The Artic bramble (Rubus arcticus L.) cultivated in Estonia. Proc. Int. Conf. «Problems of rational utilization and reproduction of berry plants in boreal forests on the eve of the XXI century». Belarus, Gomel, 1997: 158-160.
3. Vool Е., Noormets M., Karp K., Mand R., Starast M. Pollinators and their foraging behavior in arctic bramble (Rubus arcticus L.) plantations in Estonia. Proc. International Conference «Integrative approaches towards sustainability in the Baltic Sea Region». Latvia, 2003: 481-489.
4. Дворядкина А.Г. Гаплоидия у клещевины как метод создания гомозиготных форм в целях селекции. Автореф. канд. дис. Краснодар, 1972.
5. Круглова Н.Н. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы. М., 2005.
6. Kim K.-M., Baenziger P. A simple wheat haploid and doubled haploid production system using anther culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology — Plant, 2005, 41(1): 22-27 (doi: 10.1079/IVP2004594).
7. Duijs J.G., Voorrips R.E. Highly regenerative cultivars in microspore culture in Brassica oleraseae L. var. Capitata. Euphytica, 1992, 60: 45-55.
8. Домблидес Е.А., Шмыкова Н.А. Развитие пыльников капусты брокколи in vivo и при культивировании in vitro. Сб. науч. тр. Всероссийского НИИ селекции и семеноводства овощных культур. М., 2002, вып. 37: 82-92.
9. Gu H., Zhao Z., Sheng X., Yu H., Wang J. Efficient doubled haploid production in microspore culture of loose-curd cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Euphytica, 2014, 195(3): 467-475 (doi: 10.1007/s10681-013-1008-x).
10. Mandal A. Induction of androgenetic haploids in the breeding materials of winter rape (Brassica napus). Hereditas, 2008, 106(2): 189-193.
11. Илюшко М.В., Скапцов М.В., Ромашова М.В. Содержание ядерной ДНК у регенерантов риса(Oryza sativaL.), полученных в культуре пыльников in vitro. Сельскохозяйственная биотехнология, 2018, 53(3): 531-538 (doi: 10.15389/agrobiology.2018.3.531rus).
12. Kiszczak W., Kowalska U., Kapuścińska A., Burian M., Górecka K. Comparison of methods for obtaining doubled haploids of carrot. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 2017, 86(2): 3547 (doi: 10.5586/asbp.3547).
13. Шмыкова Н.А. Диморфизм пыльцы и оценка эмбриогенной способности микроспор различных генотипов моркови. Сельскохозяйственная биология, 2001, 5: 53-60.
14. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А., Монахова М.А. Цитология эмбриогенеза в культуре пыльников моркови. Физиология растений, 1999, 46(6): 876-883.
15. Takahashi Y., Yokoi S., Takahata Y. Improvement of microspore culture method for multiple samples in Brassica. Breeding Science, 2012, 61: 96-98 (doi: 10.1270/jsbbs.61.96).
16. Na H., Kwak J.H., Chun C. The effect of plant growth regulators, activated charcoal, and AgNO3 on microspore derived embryo formation in broccoli (Brassica oleracea L. var. italica). Hortic. Environ. Biotechnol., 2011, 52(5): 524-529 (doi: 10.1007/s13580-011-0034-7).
17. Sato S., Katoh N., Iwai S., Hagimori M. Effect of low temperature pretreatment of buds or inflorescence on isolated microspore culture in Brassica rapa (syn. B. campestris). Breeding Science, 2002, 52(1): 23-26 (doi: 10.1270/jsbbs.52.23).
18. Don Palmer C., Keller W.A. Overview of haploidy. In: Haploids in crop improvement II. Biotechnology in agriculture and forestry, vol. 56 /C. Don Palmer, W.A. Keller, K.J. Kasha (eds.). Springer, Berlin, Heidelberg, 2005: 3-9 (doi: 10.1007/3-540-26889-8_1).
19. Olmedilla A. Microspore embryogenesis. In: Plant developmental biology — biotechnological perspectives /E. Pua, M. Davey (eds.). Springer, Berlin, Heidelberg, 2010: 27-44 (doi: 10.1007/978-3-642-04670-4_2).
20. Peixe A., Barroso J., Potes A., Pais M.S. Induction of haploid morphogenic calluses from in vitro cultured anthers of Prunus armeniaca cv. ‘Harcot’. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 2004, 77: 35-41 (doi: 10.1023/b:ticu.0000016498.95516.e6).
21. Zontikov D., Zontikova S., Sergeev R., Sirotina M. Micropropagation of highly productive forms of diploid and triploid aspen. Advanced Materials Research, 2014, 962-965: 681-690 (doi:  10.4028/www.scientific.net/AMR.962-965.681).
22. Zontikov D., Zontikova S., Sergeev R., Shurgin A. In vitro propagation of Rubus chamaemorus L. and Rubus arcticus. Proc. Int. Conf. «14th International multidisciplinary scientific geoconference and EXPO». Albena, 2014: 397-403.
23. Murashige T.A., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 1962, 15: 473-497.
24. Пухальский В.А. Цитология и цитогенетика растений. М., 2004.
25. Shumilina D.V., Shmykova N.A., Bondareva L.L., Suprunova T.P. Effect of genotype and medium culture content on microspore-derived embryo formation in Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. chinensis) cv. Lastochka. Biology Bulletin, 2015, 42(4): 302-309 (doi:  10.1134/S1062359015040135).
26. Шмыкова Н.А., Шумилина Д.В., Супрунова Т.П. Получение удвоенных гаплоидов у видов рода Brassica L. Вавиловский журнал генетики и селекции, 2015, 1: 111-120 (doi:  10.18699/VJ15.014).
27. Lionneton E., Beuret W., Delaitre C., Ochatt S., Rancillac M. Improved microspore culture and doubled haploid plant regeneration in the brown condiment mustard (Brassica juncea). Plant Cell Reports, 2001, 20: 126-130 (doi: 10.1007/s002990000292).
28. Пивоваров В.Ф., Бондарева Н.А., Шмыкова Н.А., Шумилина Д.В., Минейкина А.И. Создание гибридов капусты белокочанной (Brassica oleracea L. convar. capitate var. alba DC) нового поколения с использованием линий удвоенных гаплоидов. Сельскохозяйственная биология, 2017, 52(1): 143-151 (doi: 10.15389/agrobiology.2017.1.143rus).
29. Монахос С.Г., Нгуен М.Л., Безбожная А.В., Монахос Г.Ф. Связь плоидности с числом хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у диплоидных и амфиплоидных видов Brassica. Сельскохозяйственная биология, 2014, 5: 44-54 (doi: 10.15389/agrobiology.2014.5.44rus).
30. Yuan S., Liu Y., Fang Z., Yang L., Zhuang M., Zhang Y., Sun P. Study on the relationship between the ploidy level of microspore-derived plants and the number of chloroplast in stomatal guard cells in Brassica oleracea. Agricultural Sciences in China, 2009, 8(8): 939-946 (doi: 10.1016/S1671-2927(08)60298-9).
31. Soroka A.I. Differentiation of haploid and dihaploid rape plants at the cytological and morphological levels. Cytol. Genet., 2013, 47(2): 88-92 (doi: 10.3103/S0095452713020102).
32. Xynias I., Koufalis A., Gouli-Vavdinoudi E., Roupakias D. Factors affecting doubled haploid plant production via maize technique in bread wheat. Acta Biologica Cracoviensia s. Botanica, 2015, 56(2): 67-73 (doi: 10.2478/abcsb-2014-0022).
33. Khokhar M.I., Razaq A., Iqbal J., Anwar M.J., Iqbal M.Z., ur Rehman S. Choice of maize genotype affects wheat haploid seed and success of embryo rescue. RADS Journal of Biological Research and Applied Science, 2019, 10(1): 1-5.