РАЗРАБОТКА НОВЫХ СИСТЕМ ПЦР-ИДЕНТИФИКАЦИИ НЕКАРАНТИННЫХ ПАТОГЕНОВ КАРТОФЕЛЯ (Solanum tuberosum L.), РАСПРОСТРАНЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ

Российская Федерация — один из крупнейших производителей картофеля в мире: за 2018 год посевные площади этой культуры на территории страны составили 310,7 тыс. га, а валовые сборы в промышленном секторе — 7157 тыс. т. Однако для современного картофелеводства характерно прогрессивное распространение вирусных болезней и бактериозов, приводящих к снижению урожая и катастрофическому ухудшению стандартного качества клубней. В настоящее время в картофелеводстве широко применяются классические методы диагностики, в частности растения-индикаторы, серологические и цитологические подходы. Они относительно надежны, но не всегда достаточно чувствительны, требуют высокой квалификации персонала и существенных затрат времени. Современной альтернативой этим методам служат диагностические системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), в частности ее модификации в формате реального времени (количественная ПЦР). В представленном исследовании для шести некарантинных патогенов (некротических штаммов Y вируса картофеля PVY^N-NTN и PVY^N:O, вируса погремковости табака, патогенных бактерий Dickeya solani, D. dianthicola, Pectobacterium atrosepticum) впервые в России были разработаны системы диагностики и идентификации в формате количественной ПЦР. Праймеры и флуоресцентно меченные зонды подбирали на основе последовательностей нуклеотидов, представленных в международной базе данных NCBI GenBank, с учетом размера ампликона не более 500 п.н. Специфичность предложенных систем была показана в тестах с генетическим материалом патогенов, таксономически близких или занимающих сходные экологические ниши: ординарный штамм PVY, вирус метельчатости верхушки картофеля, бактерии Pectobacterium carotovorum, D. zeae.Качество работы предложенных тест-систем также оценивали с использованием растительного материала, предположительно зараженного анализируемыми патогенами. Выделение нуклеиновых кислот осуществляли с использованием комплектов реактивов Проба-НК (для РНК) и Проба-ГС (для ДНК) (ООО «АгроДиагностика», Россия). Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор RevertAidPremium First Strand cDNA Synthesis Kit («Thermo Scientific», США). ПЦР проводили в амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия), количественную ПЦР — в детектирующем амплификаторе ДТ-96 («ДНК-технология», Россия). Для оценки возможного ингибирования в реакционную смесь добавляли внутренний контрольный образец (ВКО), представляющий собой плазмиду со специфической вставкой (размер 560 п.н.). Положительные контрольные образцы (ПКО) клонировали с использованием набора Quick-TA kit («Евроген», Россия). Концентрацию плазмидной ДНК определяли с помощью спектрофотометра NanoVue («GE HealthCare», США). Секвенирование молекул ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3730 («Applied Biosystems», США). Аналитическую чувствительность оценивали с использованием количественной ПЦР, при которой в качестве матрицы выступали последовательные 10-кратные разведения плазмидных ДНК (ПКО в четырех независимых повторностях) в диапазоне от 10⁷ до 10⁰ копий на реакцию. Была показана высокая чувствительность разработанных тест-систем, составившая от 10 до 500 копий специфической ДНК на реакцию, а также высокая воспроизводимость (Cv 1,5-2,0 %). Максимальное разгорание разработанных гидролизуемых зондов составило от 1200 до 2000 ед. фона. Универсальность предложенных профилей амплификации может послужить основой для адаптации тест-систем в формат мультиплексной ПЦР. Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что разработанные системы с высокой специфичностью и чувствительностью детектируют анализируемые патогены и могут быть использованы в рамках мероприятий по фитосанитарному контролю и рутинной диагностике шести некарантинных патогенов в растениях, посадочном материале и пищевой продукции.

Ключевые слова: диагностика, количественная ПЦР, чувствительность, специфичность, Pectobacterium atrosepticum, Dickeya solani, Dickeya dianthicola, некротические штаммы Y вируса картофеля, PVY, вирус погремковости табака.

Картофель — одна из основных сельскохозяйственных культур с общемировым объемом производства около 375 млн т. Существенным фактором, снижающим количество и качество получаемого картофеля, становятся болезни, вызываемые фитопатогенами различной природы, относящимися к разным таксономическим группам: ежегодные потери, связанные с вирозами, составляют 7 % от урожая, с микозами и бактериозами — 14 % (1, 2). В настоящее время известно свыше 50 возбудителей вирусных и бактериальных болезней, выявленных на картофеле в регионах с разнообразными природно-климатическими условиями (3, 4). Вместе с тем при сертификации семенного картофеля в России контролируются лишь некоторые из них, а интегрированная система мониторинга вирусных и бактериальных заболеваний этой культуры отсутствует (5, 6).

Для современного картофелеводства характерно прогрессивное распространение вирусных болезней некротической кольцевой пятнистости клубней и пестростебельности, а также бактериоза черной ножки картофеля, вызывающих, помимо снижения урожая, катастрофическое ухудшение стандартного качества клубней, что становится серьезной проблемой для товарного производства (7).

Кольцевой некроз клубней картофеля (КНКК, образование на клубнях колец и дуг темно-коричневого цвета) вызывают некротические штаммы Y-вируса (potato virus Y, PVY^N-NTN). В то же время идентифицированы вызывающие КНКК изоляты, которые обладают серологическими свойствами, характерными для ординарного штамма Y-вируса картофеля (PVY^O). Эти штаммы, выделенные в Европе, отнесены к подгруппе PVYN-Wilga некротических штаммов (по названию сорта, на котором впервые выявлен вирус с подобными свойствами) (8-10). Группа изолятов PVY с аналогичными свойствами, обнаруженных позднее в Северной Америке, получила обозначение PVY^N:O (11). Геном PVY представляет собой одноцепочечную РНК длиной около 9700 п.н. На сегодняшний день для всех перечисленных групп изолятов определены структуры полных геномов и их полиморфизм, что значительно упрощает исследования и разработку систем диагностики (12). Пестростебельность картофеля, которая проявляется образованием некротических дуг и пятен как на поверхности клубня, так и внутри паренхимной ткани, вызывается вирусом погремковости табака (tobacco rattle virus, TRV, раттл-вирус), распространяемым почвенными нематодами отряда Dorylaimida рода Trichodorus (13, 14).

По данным Лаборатории фитопаразитологии ЦПИПЭ РАН, которая ведет изучение распространения нематод-триходорид, в 75 % образцов растений, зараженных триходоридами, обнаруживается раттл-вирус (15). TRV относится к типичным патогенам природно-очаговых заболеваний. Уже в первый год попадания здорового растения картофеля в инфекционный очаг урожай клубней становится нетоварным (16, 17). Вызываемая вирусом болезнь описана во многих странах, а в середине 1970-х годов выявлена на территории бывшего СССР (16). Вирус широко представлен в Нидерландах, Германии, Бельгии, Англии, Франции, Польше, Швеции, Австрии, Финляндии, США, Японии, странах Балтии и России (18-20). Идентификация TRV затруднена, поскольку во многих случаях наблюдается смешанная инфекция (15, 17). Геном TRV состоит из линейной одноцепочечной РНК и включает две части — РНК-1 и РНК-2, общий размер — от 9000 до 11500 п.н. (21). В настоящее время расшифровано значительное количество структур полных геномов этого вируса для изолятов различного географического происхождения (22, 23).

Распространение бактериоза черной ножки картофеля за последние годы заметно прогрессирует. Выявлен ряд новых возбудителей, вызывающих водянистую гниль стеблей и мягкие гнили клубней (24). Симптомы поражения клубней и растений картофеля бактериями рода Dickeya spp. во многом сходны с симптомами при заражении бактериями рода Pectobacterium spp. (25). Вместе с тем виды Dickeya spp. могут вызывать болезнь при наличии небольшого количества инфекционного агента, легче распространяются по сосудистым тканям растений, агрессивнее, а при повышенной температуре поражение мокрой гнилью сильнее, чем в случае инфицирования Pectobacterium аtroseptica. Для Dickeya spp. характерно распространение в регионах с жарким климатом, однако в связи с локальными изменениями климатических условий отмечено их продвижение в регионы с умеренным климатом, традиционные для производства картофеля. Важным этапом в исследованиях этих бактериальных патогенов стала расшифровка структур полных геномов (26-28).

Основной способ радикальной борьбы с вирусными и бактериальными болезнями картофеля заключается в выявлении возбудителей заболеваний на ранних этапах семеноводства с последующей выбраковкой инфицированного материала. Классические методы диагностики надежны, однако зачастую не обладают достаточной чувствительностью, а также требуют высокой квалификации персонала и существенных затрат времени (29). В связи с этим необходимы новые отечественные ПЦР тест-системы для выявления патогенов, ухудшающих качество товарного картофеля и наносящих значительный экономический ущерб.

В настоящем исследовании для шести некарантинных патогенов (некротических штаммов Y вируса картофеля PVY^N-NTN и PVY^N:O, вируса погремковости табака, патогенных бактерий Dickeya solani, Dickeya dianthicola, Pectobacterium atrosepticum) впервые в России были разработаны системы диагностики и идентификации в формате количественной ПЦР.

Цель работы — создание оригинальных отечественных систем для идентификации некарантинных патогенов картофеля на основании количественной полимеразной цепной реакции, оценка чувствительности и эффективности этих систем, а также возможности их применения в практике фитопатологического анализа.

Методика. Исследовали выделенные и поддерживаемые во Всероссийском НИИ картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха (ВНИИКХ) образцы фитопатогенов: PVY^NTN, PVY^N:O, TRV, Pectobacterium atrosepticum, Dickeya solani, Dickeya dianthicola. Кроме того, были использованы образцы фитопатогенов, близких в таксономическом отношении либо сходных по симптоматике при заражении растений картофеля: PVY (potato virus Y, обычный штамм), вирус метельчатости верхушки картофеля (potato mop top virus, PVTV), Pectobacterium carotovorum, Dickeya zeae. Эти образцы выделяли при тестировании семенного материала, поступающего из Центрального и Южного федеральных округов Российской Федерации. Для оценки использовали моноклональные антитела фирмы «Bioreba» (Швейцария). Кроме того, предложенные тест-системы были апробированы на генетическом материале 9 образцов клубней картофеля (Solanum tuberosum L.) различных сортов из Московской области, предположительно зараженных анализируемыми патогенами.

Нуклеиновые кислоты выделяли с использованием комплектов реактивов Проба-НК (для РНК) и Проба-ГС (для ДНК) (ООО «АгроДиагностика», Россия) в соответствии с протоколом производителя. Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit («Thermo Scientific», США).

Дизайн праймеров и флуоресцентно меченных зондов выполняли с помощью выравнивания последовательностей нуклеотидов ряда локусов детектируемых организмов, депонированных в базе данных National Center for Biotechnology Information (GenBank, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Для выравнивания использовали алгоритм ClustalW (30). Подбор и оценку физико-химических свойств олигонуклеотидов осуществляли в программе Oligo v. 6.71 (https://www.oligo.net/oligo_updates.htm)

ПЦР проводили в амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия) в соответствии со следующими программами: для пар праймеров Y-NTN(F-R), Y-NW(F-R), TRV(F-R), Dsol(F-R) — 90 с при 93 °С; 20 с при 93 °С, 5 с при 64 °С, 5 с при 67 °С (5 циклов); 1 с при 93 °С, 5 с при 64 °C, 5 с при 67 °С (40 циклов); для Patr(F-R), Ddi(F-R) — 90 с при 93 °С; 20 с при 93 °С, 5 с при 64 °С, 5 с при 67 °С (5 циклов); 1 с при 93 °С, 5 с при 60 °C (40 циклов). Количественную ПЦР осуществляли в детектирующем амплификаторе ДТ-96 («ДНК-технология», Россия) по аналогичным программам амплификации. Для анализа полученных результатов использовался пороговый метод (31). Каждый из образцов ДНК был протестирован в трех повторностях. Состав ПЦР-буфера и методика разделения продуктов амплификации с помощью гель-электрофореза описаны в более ранних публикациях (32, 33).

Для оценки возможного ингибирования в реакционную смесь добавляли внутренний контрольный образец (ВКО), представляющий собой плазмиду pTZ57R/T со специфической вставкой (размер 560 п.н.), то есть реакция происходила в мультиплексном формате. Положительные контрольные образцы (ПКО) клонировали с использованием набора Quick-TA kit («Евроген», Россия) по протоколу производителя. Концентрацию плазмидной ДНК определяли с помощью спектрофотометра NanoVue («GE Healthcare», США). Секвенирование молекул ДНК проводили в ЗАО «Евроген», используя набор реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 («Applied Biosystems», США), с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3730 («Applied Biosystems», США).

Аналитическую чувствительность оценивали в количественной ПЦР с последовательными 10-кратными разведениями плазмидных ДНК в качестве матрицы (ПКО в четырех независимых повторностях) в диапазоне от 107 до 100 (единичные копии) копий на реакцию. Для каждого ПКО строили график линейной зависимости порогового цикла от числа копий специфической ДНК в реакции.

Для оценки воспроизводимости использовали стандартные отклонения ±SD, вычисленные с учетом усредненного значения Сq для серии разведений. Вариабельность значений Cq оценивали с помощью тестирования каждого разведения три раза в трех повторностях. Также вычисляли коэффициенты вариации (Сv, %).

Результаты. На основании анализа последовательностей нуклеотидов, представленных в GenBank для анализируемых патогенов, для дизайна праймеров и зондов мы выбрали следующие локусы: для PVY^NTN — ген белка оболочки (GU980964, AF321554, AJ535662, GU550076, AJ315774), для PVY^N:O — ген VPg (EF638893, EF638901, EF638902-638892), для TRV —ген РНК-зависимой РНК полимеразы (JX267264-267270, MF918561-918567), для D. dianthicola— ген s-фактора РНК полимеразы (rpoD, MH118541, LC275948-275957). Для остальных патогенов использовали маркерные фрагменты последовательностей полных геномов: P. atrosepticum (CP024956, CP009125, CP007744), D. solani (CP024710, CP017453, CP016928). При подборе праймеров выравнивали соответствующие локусы целевых патогенов и близкородственных таксонов. Также принимали во внимание желательную температуру отжига праймеров не ниже 60 °С. В итоге 4 пары праймеров имели расчетную температуру отжига 64 °С, 2 пары — 60 °С. Структура и свойства разработанных праймеров, а также размеры продуктов амплификации приведены в таблице 1.

Для оценки специфичности разработанных праймеров, помимо ДНК или кДНК анализируемых патогенов, использовали генетический материал близкородственных или занимающих сходные экологические ниши организмов, таких как обычный штамм PVY, вирус метельчатости верхушки картофеля (PVTV), бактерии Pectobacterium carotovotum, Dickeya zeae. Электрофоретический анализ продуктов амплификации показал, что все использованные пары праймеров строго специфичны. В дальнейшем это был анализ в формате количественной ПЦР (табл. 2).

Другой важный показатель качества работы диагностической системы — ее аналитическая чувствительность, для определения которой использовали 10-кратные разведения плазмид (ПКО) с известными концентрациями и числом копий в реакционной смеси. Наибольшей чувствительностью обладали системы идентификации PVYNTN и D. dianthicola (около 10 копий плазмиды с соответствующим клонированным фрагментом ДНК на реакцию), наименее чувствительной из всех была система идентификации P. atrosepticum (500 копий на реакцию) (табл. 3).

Диапазон значений эффективности для разработанных тест-систем колебался от 91,2 до 98,0 %. Значения стандартных отклонений при тестировании каждого из 10-кратных разведений в трех повторностях варьировали от 0,09 до 0,53, величина Cv не превышала 2 %. На рисунке 1 в качестве примера приведены графики зависимости порогового цикла от числа копий плазмид с клонированными фрагментами ДНК целевых объектов (ПКО) на одну реакцию, а также графики накопления флуоресцентного сигнала на примере тест-систем для PVYNTN и D. dianthicola.

Качество предложенных тест-систем также оценили с использованием клубней картофеля разных сортов, предположительно зараженных анализируемыми патогенами. При постановке ПЦР, помимо специфических праймеров и зондов, в реакционную смесь добавляли плазмиду ВКО, соответствующую пару праймеров и зонд. У всех девяти образцов картофеля на электрофореграммах продуктов ПЦР кДНК/ДНК с парами праймеров, специфичными в отношении PVYNTN и D. dianthicola, присутствовала полоса, соответствующая продукту амплификации ВКО, что указывает на отсутствие ингибирования реакции (рис. 2). В свою очередь, отсутствие специфической полосы в пробирках отрицательного контроля свидетельствует об отсутствии контаминации рабочей зоны специфическими ампликонами. Как следует из представленных электрофореграмм, кДНК вируса PVYNTN присутствовала в образцах №№ 3 (сорт Ред Скарлетт), 4 (сорт Жуковский ранний), 7 (сорт Фаворит III), 8 (сорт Помдор), 9 (сорт Флорис), а ДНК D. dianthicola — в образцах №№ 2 (сорт Ред Скарлетт), 3 (сорт Ред Скарлетт), 6 (сорт Романо), 8 (сорт Помдор), 9 (сорт Флорис).

Отметим, что в литературе в настоящее время описаны несколько вариантов тест-систем для идентификации патогенов, изучаемых в настоящей работе. В.К. Швидченко с соавт. (34) показали, что метод ПЦР в реальном времени существенно более специфичен, чем ИФА, при диагностике вирусов картофеля, в том числе PVY (диагностическая чувствительность ИФА относительно ПЦР-РВ — 68 %). Предложен ряд систем в формате мультиплексной ПЦР, в частности для определения некротических штаммов PVY^N:O и PVY^NTN (35), а также основных пектинолитических бактерий, включая P. atrosepticum и Dickeya spp. (минимальная чувствительность — 0,01 нг/мкл специфической ДНК) (36), однако они не были адаптированы в формат количественной ПЦР. Праймеры, позволяющие специфично различать виды рода Dickeya, были описаны в 2013 году (37) и успешно использованы при выявлении патогенов в овощных культурах на территории Северной Ирландии (38). Для такой тест-системы показана очень высокая чувствительность, составившая около 0,05 пг ДНК на реакцию (около 10 копий плазмидной ДНК). Также, описан ряд систем диагностики вируса погремковости табака разной чувствительности (39-41). В работе R. Holeva с соавт. (42) чувствительность системы составила около 1 фг плазмидной ДНК на реакцию (приблизительно 102 копий).

Таким образом, основные характеристики предложенных тест-систем оказались близки к таковым у наиболее эффективных зарубежных аналогов или даже превосходили их. Чувствительность систем составила от 10 до 500 копий специфической ДНК на реакцию, а эффективность амплификации превышала 90 %. Показана высокая воспроизводимость получаемых результатов (Cv не более 2 %, стандартные отклонения по разведениям — не более 0,53). Отмечена высокая степень разгорания специфических зондов, а также оптимизирована система внутреннего контроля. Качество работы тест-систем подтверждено тестами с использованием растительного материала, зараженного исследуемыми патогенами. Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что разработанные тест-системы с высокой чувствительностью и специфичностью идентифицируют шесть некарантинных патогенов картофеля, наносящих существенный экономический ущерб. Эти системы могут стать важным компонентном мониторинга зараженности посадочного материала, растений и пищевой продукции фитопатогенами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Oerke E.-C. Crop losses to pests. The Journal of Agricultural Science,2006, 144(1): 31-43 (doi: 10.1017/S0021859605005708).
2. Malko A., Frantsuzov P., Nikitin M., Statsyuk N., Dzhavakhiya V., Golikov A. Potato pathogens in Russia’s regions: an instrumental survey with the use of real-time PCR/RT-PCR in matrix format. Pathogens,2019, 8(1): 18 (doi: 10.3390/pathogens8010018).
3. Говоров Д.Н., Живых А.В., Новоселов Е.С., Голиков А.Г. Мониторинг бактериальных и вирусных болезней сельскохозяйственных культур. Защита и карантин растений, 2015, 7: 35-37.
4. Шляхов В.А., Григорян Л.Н. Идентификация вирусных болезней картофеля методом ПЦР-диагностики на территории Астраханской области. Живые и биокосные системы, 2017, 21: 6.
5. ГОСТ 33996-2016. Картофель семенной. Технические условия и методы определения качества. М., 2017.  
6. Gera A., Marco S. Detection and identification of viruses in potatoes. In: Virus and virus-like diseases of potato and production of seed-potatoes /G. Loebenstein, P.H. Berger, A.A. Brunt, R.H. Lawson (eds.). Springer, Dordrecht, 2000: 271-283 (doi: 10.1007/978-94-007-0842-6).
7. Анисимов Б.В., Белов Г.Л., Варицев Ю.А., Еланский С.Н., Журомский Г.К., Завриев С.К., Зейрук В.Н., Иванюк В.Г., Кузнецова М.А., Пляхневич М.П., Пшеченков К.А., Симаков Е.А., Склярова Н.П., Сташевски З., Усков А.И., Яшина И.М. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. М., 2009.
8. Chrzanowska М. New isolates of the necrotic strain of potato virus Y (PVYN) found recently in Poland (doi: 10.1007/BF02358039).
9. Visser J.C., Bellstedt D.U., Pirie M.D. The recent recombinant evolution of a major crop pathogen potato virus Y. PLоS ONE, 2012, 7(11): e50631 (doi: 10.1371/journal.pone.0050631).
10. Ribeiro S.R.R.P., Pinto C.A.B.P, Costa S.B.F.G., Menezes M., dos Reis Figueira A.R. Resistance of potato clones to necrotic recombinant strains of potato virus Y (PVY). Ciência e Agrotecnologia, 2014, 38(4): 343-351 (doi: 10.1590/S1413-70542014000400004).
11. Dougherty W.G., Carrington J.C. Expression and function of polyviral gene products. Annual Review of Phytopathology, 1988, 26: 123-143 (doi: 10.1146/annurev.py.26.090188.001011).
12. Hu X., Karasev A.V., Brown C.J., Lorenzen J.H. Sequence characteristics of potato virus Y recombinants. Journal of General Virology, 2009, 90(12): 3033-3041 (doi: 10.1099/vir.0.014142-0).
13. Козырева Н.И., Романенко Н.Д. Распространение нематод семейства Trichodoridae — переносчиков тобравирусов в Московской области. Паразитология, 2008, 42(5): 428-434.
14. Romanenko N.D., Kozireva N.I. Investigations of trichodorid nematodes (Nematoda: Trichodoridae) and tobraviruses in Russia. Russian Journal of Nematology, 1998, 6(1): 77.
15. Kozyreva N.I. The distribution of tobacco rattle virus and trichodorid nematodes in potato fields of the Moscow region. Russian Journal of Nematology, 2001, 2: 150.
16. Ларина Э.И., Теплоухова Т.Н. Вирус погремковости табака. Защита растений, 1975, 3: 51.
17. Рогозина Е.В., Мироненко Н.В., Афанасенко О.С., Мацухито Ю. Широко распространенные и потенциально опасные для российского агропроизводства возбудители вирусных болезней картофеля. Вестник защиты растений, 2016, 4(90): 24-33.
18. Cooper J.I. The distribution in Scotland of tobacco rattle virus and its nematode vectors in relation to soil type. Plant Pathology, 1971, 20(2): 51-58 (doi: 10.1111/j.1365-3059.1971.tb00510.x).
19. Beuch U., Persson P., Edin E., Kvarnheden A. Necrotic diseases caused by viruses in Swedish potato tubers. Plant Pathology, 2014, 63(3): 667-674 (doi: 10.1111/ppa.12141).
20. Yellareddygari S.K.R., Brown C.R., Whitworth J.L., Quick R.A., Hamlin L.L., Gudmestad N.C. Assessing potato cultivar sensitivity to tuber necrosis caused by Tobacco rattle virus. Plant Disease, 2018, 102(7): 1376-1385 (doi: 10.1094/PDIS-12-17-1918-RE).
21. Minson T., Dabby G. 3'-terminal oligonucleotide fragments of tobacco rattle virus ribonucleic acids. Journal of Molecular Biology, 1973, 77(2): 337-340 (doi: 10.1016/0022-2836(73)90339-2).
22. Crosslin J.M., Hamm P.B., Kirk W.W., Hammond R.W. Complete genomic sequence of a Tobacco rattle virus isolate from Michigan-grown potatoes. Archives of Virology, 2010, 155(4): 621-625 (doi: 10.1007/s00705-010-0609-0).
23. Kim Y.J., Lim M.S., Kim S.M., Ryu K.H., Choi S.H. Molecular characterization of the Tobacco rattle virus RNA2 genome isolated from Gladiolus. Acta Biologica Hungarica, 2015, 66(2): 222-230 (doi: 10.1556/018.66.2015.2.8).
24. Игнатов А.Н. Необходимо усилить борьбу с бактериозами картофеля. Картофель и овощи, 2011, 5: 28-29.
25. Toth I.K., van der Wolf J.M., Saddler G., Lojkowska E., Hélias V., Pirhonen M., Tsror (Lakhim) L., Elphinstone J.G. Dickeya species: an emerging problem for potato production in Europe. Plant Pathology, 2011, 60(3): 385-399 (doi: 10.1111/j.1365-3059.2011.02427.x).
26. Shneider M.M., Kabanova A.P., Korzhenkov A.A., Miroshnikov K.K., Thi N.H.V., Toshchakov S.V., Miroshnikov K.A., Ignatov A.N. Draft genome sequence of Pectobacterium atrosepticum PB72 and complete genome sequence of the specific bacteriophage PP90. Genome Announcements, 2018, 6: e00473-18 (doi: 10.1128/genomeA.00473-18).
27. Khayi S., Blin P., Chong T.M., Robic K., Chan K.-G., Faure D. Complete genome sequences of the plant pathogens Dickeya solani RNS 08.23.3.1.A and Dickeya dianthicola RNS04.9. Genome Announcements, 2018, 6: e01447-17 (doi: 10.1128/genomeA.01447-17).
28. Li X., Ma Y., Liang S., Tian Y., Yin S., Xie S., Xie H. Comparative genomics of 84 Pectobacterium genomes reveals the variations related to a pathogenic lifestyle. BMC Genomics, 2018, 19(1): 889 (doi: 10.1186/s12864-018-5269-6).
29. Ryazantsev D.Yu., Zavriev S.K. An efficient diagnostic method for the identification of potato viral pathogens. Molecular Biology, 2009, 43(3): 515-523 (doi: 10.1134/S0026893309030200).
30. Saitou N., Nei M. The neighbour-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4(4): 406-425 (doi: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040454).
31. Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., Vandesompele J., Wittwer C.T. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR. Clinical Chemistry, 2009, 55(4): 611-622 (doi: 10.1373/clinchem.2008.112797).
32. Stakheev A.A., Ryazantsev D.Yu., Gagkaeva T.Yu., Zavriev S.K. PCR detection of Fusarium fungi with similar profiles of the produced mycotoxins. Food Control, 2011, 22(3-4): 462-468 (doi: 10.1016/j.foodcont.2010.09.028).
33. Stakheev A.A., Khairulina D.R., Zavriev S.K. Four-locus phylogeny of Fusarium avenaceum and related species and their species-specific identification based on partial phosphate permease gene sequences. International Journal of Food Microbiology, 2016, 225: 27-37 (doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2016.02.012).
34. Швидченко В.К., Хасанов В.Т., Фида М.А., Бейсембина Б., Харченко П.Н., Алексеев Я.И., Благодатских К.А., Казанцев А.С., Минакова Н.Ю. Сравнение методов иммуноферментного анализа и ПЦР в реальном времени для диагностики зараженности сортообразцов картофеля вирусами. Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук, 2014, 2: 47-49.
35. Nie X., Singh R.R. Specific differentiation of recombinant PVYN:0 and PVYNTN isolates by multiplex RT-PCR. Journal of Virological Methods, 2003, 113(2): 69-77 (doi: 10.1016/S0166-0934(03)00221-0).
36. Potrykus M., Sledz W., Golanowska M., Slawiak M., Binek A., Motyka A., Zoledowska S., Czajkowski R., Lojkowska E. Simultaneous detection of major blackleg and soft rot bacterial pathogens in potato by multiplex polymerase chain reaction. Annals of Applied Biology, 2014, 165(3): 474-487 (doi: 10.1111/aab.12156).
37. Pritchard L., Humphris S., Saddler G.S., Parkinson N.M., Bertrand V., Elphinstone J.G., Toth I.K. Detection of phytopathogens of the genus Dickeya using PCR primer prediction pipeline for a draft bacterial genome sequences. Plant Pathology, 2013, 62(3): 587-596 (doi: 10.1111/j.1365-3059.2012.02678.x).
38. Zaczek-Moczydłowska M., Fleming C.C., Young G.K., Campbell K., O’Hanlon R. Pectobacterium and Dickeya species detected in vegetables in Northern Ireland. European Journal of Plant Pathology, 2019, 154(3): 635-647 (doi: 10.1007/s10658-019-01687-1).
39. Mumford R.A., Walsh K., Barker I., Boonham N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus using a multiplex real-time fluorescent reverse-transcription polymerase chain reaction assay. Phytopathology, 2000, 90(5): 448-453 (doi: 10.1094/PHYTO.2000.90.5.448).
40. Xu H., Nie J. Molecular detection and identification of potato isolates of Tobacco rattle virus. Canadian Journal of Plant Pathology, 2006, 28(2): 271-279 (doi: 10.1080/07060660609507296).
41. Holeva R., Philips M.S., Neilson R., Brown D.J.F., Young V., Boutsika K., Blok V.C. Real-time PCR detection and quantification of vector trichodorid nematodes and tobacco rattle virus. Molecular and Cellular Probes, 2006, 20(3-4): 203-211 (doi: 10.1016/j.mcp.2005.12.004).