doi: 10.15389/agrobiology.2015.1.3rus
УДК 633/635:581.4:579.64
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ
С ТКАНЯМИ РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ in vitro: ИДЕНТИФИКАЦИЯ И
ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ (обзор)
С.Е. ДУНАЕВА1, Ю.С. ОСЛЕДКИН2
Эффективная стерилизация растительных эксплантов и соблюдение правил антисептики не исключают присутствия в in vitro культурах так называемых скрытых (эндофитных) бактерий. Роль этих бактерий в культурах тканей мало изучена, однако ее, например, связывают с регенерационной способностью эксплантов и возможностью трансформировать культивируемые in vitro клетки животных и человека. Бактериальные штаммы, патогенные для человека, могут устойчиво сохраняться в пассируемых культурах и в растениях ex vitro. Расширение среды обитания бактерий создает экологические и генетические риски, которые определяют необходимость тщательного мониторинга эндофитных сообществ в растениях, употребляемых в пищу в сыром виде, а также при применении in vitro технологий в практическом растениеводстве и для получения продуктов питания. Идентификация бактериальных микроорганизмов, колонизирующих in vitro культуры растений, дает возможность изучать влияние бактерий на хозяина, проводить направленную химиотерапию, создавать банк данных микроорганизмов, ассоциированных с культурой растительных тканей. Наиболее распространены два метода идентификации — традиционный, более доступный, но не позволяющий выявлять некультивируемые формы (он основан на использовании культуральных и морфологических характеристик, а также химических и биохимических реакций), и молекулярно-генетический. В последнем случае с использованием метагеномной ДНК и соответствующих специфических праймеров определяют различные последовательности 16S-рРНК, имеющие как консервативные сайты, одинаковые у всех прокариотов, так и пригодные для идентификации видоспецифичные участки. Внутренние транскрибируемые спейсеры (internal transcribed spacers — ITS) преимущественно применяют для различения микроорганизмов на уровне видов и даже штаммов. Таксономический состав бактериальных эндофитов свидетельствует об их разнообразии и отсутствии специфического набора в in vitro культурах растений разной систематической принадлежности и в эксплантах, относящихся к разным органам растения. Среди идентифицированных эндофитных бактерий выявлены потенциально полезные для интактных растений, в частности Streptomycete, Pantoea agglomerans и др., а также патогенные для человека, например Ralstonia mannitolytica, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium amycolatum, Bacillus neonatiensis, Salmonella и Nocaridia spp. При in vitro культивировании растительных объектов длительное бессимптомное присутствие бактерий обусловлено, с одной стороны, подавлением их роста факторами, сопровождающими культивирование растительных эксплантов (pH, температура ниже оптимума для роста бактерий, активирование защитных механизмов), с другой — одновременным поддержанием жизнедеятельности бактерий за счет экссудатов, выделяемых растительным эксплантом. Быстрая пролиферация бактериальных клеток может наступить даже при небольших изменениях первоначальных условий, при увеличении концентрации растительных экссудатов и вследствие собственно in vitro культивирования как стресса в отсутствие регулирующей роли целого организма. По мере увеличения числа пассажей доля растительных культур со скрытой бактериальной контаминацией возрастает. Имеются данные, что при этом некультивируемые эндофиты могут приобретать статус культивируемых. Скрытые бактериальные контаминации способны угнетать регенерацию, микроклональное размножение, вызывать гибель культивируемых in vitro растительных объектов, служить препятствием для воспроизводимости протоколов и иметь отношение к появлению эпигенетических сомаклональных вариантов. Так, фильтраты изолятов Acinetobacter и Lactobacillus plantarum, выделенных из деградирующих каллусов, при инокуляции в экспланты или добавлении в питательную среду резко снижали регенерацию побегов, а бактерии Mycobacterium obuense и M. aichiense угнетали развитие семян в культуре in vitro. Акцентируется проблема получения гнотобиотических растительных культур (в частности, в in vitro коллекциях генетических банков растений), обусловленная сложностью выявления и элиминации бактериальных микроорганизмов.
Ключевые слова: культура тканей растений, бактериальные микроорганизмы, антибактериальная терапия.
S.E. Dunaeva1, Yu.S. Osledkin2
Effective sterilization of plant explants and antiseptics rules compliance do not exclude the presence of so-called covert (endophytic) bacteria in in vitro cultures. But the role of these bacteria in tissues cultures has been not enough studied whereas it was related to the explants regeneration capacity and the possibility of animal and human cells transformation under in vitro cultivation. Bacterial strains pathogenic to humans can be stably maintained in cultivated tissues and ex vitro plants. The broadening of bacterial environments creates ecological and genetic risks leading to necessity of careful monitoring of endophytic communities in plants used as raw food and at use of in vitro technologies in practical plant growing and food production. Identification of bacterial microorganisms colonizing in vitroplant cultures allows studying the bacteria effect on the host, realizing special chemotherapy and developing the microorganisms’ databases. Two methods of identification are the most widespread: more available traditional one that does not allow detecting non-cultured forms (its base is the use of cultural and morphological characteristics as well as chemical and biochemical reactions) and molecular-genetic one. At the second approach different 16S-rRNA sequences are studied using metagenomic DNA and appropriate specific primers; these sequences have conserved sites identical for all prokaryotes and variable ones suitable for species specific regions identification. Internal transcribed spacers (ITS) are being mainly used to distinguish the microorganisms at the species level and even at strains one. Taxonomy of in vitro cultures’ bacterial endophytes indicates to their diversity and absence of specific composition as for cultures of plants belonging to different taxa as for different plant organs explants. Among identified endophytic bacteria potentially useful for intact plants Streptomycete, Pantoea agglomerans and others were found as well as those pathogenic for humans, e.g. Ralstonia mannitolytica, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium amycolatum, Bacillus neonatiensis, Salmonella and Nocaridia spp. At in vitro plant cultivation durable symptomless bacterial presence is caused on the one hand by bacterial growth repression with factors accompanying plant explants cultivation (PH, temperature below bacterial optimum, activation of the defense mechanisms), and on the other hand by simultaneous bacteria support due to exudates secreted by plant explants. The rapid bacterial cells proliferation can begin even at small changes in initial conditions, at increase in plant exudates concentrations and per se in consequence of in vitro cultivation as a stress at the absence of whole organism regulatory role. As the number of subcultivations increases a portion of plant cultures with latent bacterial contamination increases too; no-cultured endophytes have been reported to acquire the status of cultured ones. Covert bacterial contamination could depress regeneration, micropropagation, cause death of in vitro cultivated objects, restrict the protocols repeatability and concern induction of epigenetic somaclonal variability. For instance Acinetobacter and Lactobacillus plantarum filtrates extracted from degrading calluses strongly reduced shoot regeneration at inoculation in explants or addition into a medium; bacteria Mycobacterium obuense and M. aichiense repressed seeds development in in vitro cultures. The article accents the problem of gnotobiological plant cultures (specifically in in vitrocollections of plants genetic banks) development caused by difficulties in identification and elimination of bacterial microorganisms.
Кeywords: plant tissue culture, bacterial microorganisms, antibacterial therapy.
1ГНУ Всероссийский НИИ растениеводства |
Поступила в редакцию |
Оформление электронного оттиска
