УДК 635.21:632.3:632.981.1

АНТИФУНГАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ δ-ЭНДОТОКСИНА Bacillus thuringiensis В ОТНОШЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИТОФТОРОЗА КАРТОФЕЛЯ В ПОЛЕВЫХ УСЛОВИЯХ И ПРИ ХРАНЕНИИ

Л.К. КАМЕНЕК, Т.А. САТАРОВА, Д.В. КАМЕНЕК, М.А. ТЕРПИЛОВСКИЙ

На растениях картофеля сорта Невский в полевых условиях (естественный инфекционный фон), а также при хранении клубней картофеля сортов Ресурс и Ильинский определяли степень распространения фитофтороза и степень поражения растений и клубней при обработке разными дозами δ-эндотоксина, выделенного из Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, по сравнению с использованием стандартных химических препаратов (метамил, ридомил, максим).

Ключевые слова: биологическая защита растений, фитофтороз, антифунгальное действие, δ-эндотоксины Bacillus thuringiensis.

 

Фитофтороз относят к числу наиболее вредоносных болезней картофеля. Возбудитель заболевания — гриб Phytophthora infestans (класс Oomycetes), широко распространенный в условиях умеренного пояса. Патоген поражает листья, стебли, клубни, ростки картофеля. Ущерб усугубляется тем, что зараженные клубни при хранении сгнивают (потери урожая при эпифитотиях достигают 50-70 %).

Популяции гриба высоколабильны, неоднородны и состоят из различных по вирулентности рас. В силу этого, во-первых, возникают трудности при селекции устойчивых сортов картофеля, во-вторых, требуется применение фунгицидов, уменьшающих зараженность и гарантирующих получение удовлетворительного урожая даже в благоприятные для развития болезни годы, что приводит к накоплению в почве и клубнях остатков вредных для человека химических веществ. Очевидна необходимость разработки альтернативных методов борьбы с фитопатогенными грибами, минимизирующих вред, наносимый окружающей среде. Такой альтернативой служит биологический метод, основанный на применении микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности.

δ-Эндотоксины относятся к семейству гомологичных полипептидов, входящих в состав параспоральных включений (кристаллов), продуцируемых многочисленными подвидами бактерии Bacillus thuringiensis Berliner (1). δ-Эндотоксины привлекают внимание исследователей благодаря эффективному высокоспецифичному действию на насекомых. Описан комплекс патологических изменений клеток, происходящих в результате воздействия этих соединений (2). Однако в последние годы, помимо инсектицидного эффекта δ-эндотоксинов, установлены их антибактериальные и антифунгальные свойства (3-5). Так, показана перспективность использования δ-эндотоксинов B. thuringiensissubsp.kurstaki при подавлении слизистого бактериоза капусты, корневых гнилей злаковых культур, бурого бактериоза овса (6, 7). В то же время данных о воздействии δ-эндотоксинов B. thuringiensis на патогенные грибы, в частности на грибы рода Phytophthora, вызывающие опасные заболевания растений, недостаточно.

Целью нашей работы была оценка фитозащитных свойств d-эндо-токсина Bacillus thuringiensis и изучение особенностей его действия на возбудителя фитофтороза картофеля.

Методика. Использовались культура В. thuringiensissubsp.thuringiensis (штамм 202), полученная из Всероссийского НИИ генетики и селекции микроорганизмов (г. Москва) и P. infestans(Mont.) de Bary штамм 3 (возбудитель фитофтороза картофеля и томатов) из коллекции кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

B. thuringiensis культивировали на агаризованной питательной среде РПА (рН 7,2-7,5) при температуре 27 °С. Фитопатогенные грибы выращивали на картофельно-глюкозном агаре (рН 6,6) при температуре 28 °С. Биомассу B. thuringiensis, содержащую кристаллы эндотоксинов и споры продуцента, отмывали дистиллированной водой от компонентов питательной среды и водорастворимых токсинов, осаждая споры и кристаллы центрифугированием. Степень очистки спорокристаллических комплексов оценивали при помощи световой микроскопии. Кристаллы отделяли от спор последовательной флотацией и экстракцией в двухфазной системе хлороформ—водный раствор Na2SO4. Щелочной гидролиз кристаллов проводили по методу K.E. Cooksey (8), полученный раствор диализировали против 0,04 н. раствора NaOH и разбавляли водой до необходимой концентрации (рН раствора снижали до 7,8 осторожным титрованием 0,1 н. HCl). Полученные таким образом препараты были свободны от компонентов культуральной жидкости, включая экзотоксины и экзоферменты бактерий.

Влияние δ-эндотоксина B. thuringiensis на степень поражения фитофторозом изучали у картофеля сорта Невский на искусственном и естественном инфекционном фоне.

Полевые эксперименты проводили на базе Биологической станции по выращиванию картофеля (пос. Охотничий, Ульяновская обл.) на фоне традиционной для хозяйства агротехники (применение удобрений, инсектицидов, гербицидов, культивации, прополки и т.д.) в сезоны 2004-2007 годов. В схеме посадки междурядье составляло 70 см, расстояние между растениями в ряду — 30-35 см; повторность опытов — 6-кратная. В качестве фунгицидов использовали смесь d-эндотоксина (1 %) с NaCl (в качестве наполнителя), а также химические препараты метамил (МЦ сп 72 %) и ридомил. Норма расхода препаратов в полевых условиях составляла 60 г/га — для δ-эндотоксина, 100 г/га — для метамила и 750 г/га — для ридомила. Растения (наземные части) обрабатывали в период окончания бутонизации (конец июня) рабочими смесями с помощью ранцевого опрыскивателя Titan 12 («Marolex», Польша). Здоровые и пораженные растения учитывали через 3, 7, 10 и 14 сут после опрыскивания. На контрольных делянках обработки растений фунгицидами не проводили (9).

Степень поражения растений картофеля оценивали по 5-балльной шкале, отражающей визуально-качественную и количественную характеристики поражения (10). Степень развития болезни (%) рассчитывали по формуле:

,

где ∑S(a x b) — сумма произведений числа пораженных растений на соответствующий балл развития болезни; H — общее число учетных растений, шт.; К — высший балл шкалы учета.

Распространенность болезни (%) определяли, как

,

где n — число больных растений в варианте, шт.; Н — общее число учетных растений, шт.

Биологическую эффективность (%) препаратов вычисляли по следующей формуле:

,

где РК — показатель развития болезни в контроле; РO — показатель развития болезни в опыте.

Для оценки влияния δ-эндотоксина на развитие фитофтороза при хранении отбирали зрелые клубни картофеля сортов Ресурс и Ильинский без внешних признаков поражения фитофторозом (естественный инфекционный фон) (50 шт. в каждой из 4 повторностей варианта). Клубни содержали в условиях стационарного хранилища в ящиках при 1-3 °C и относительной влажности воздуха 85-90 %, диагностируя по визуальным признакам (окончательную идентификацию осуществляли после выделения грибного патогена в чистую культуру). Обработку клубней при хранении проводили раствором δ-эндотоксина из расчета 75 и 150 мг/кг клубней (по действующему веществу — 7,5 и 15,0 мг/кг) и химическим препаратом максим (кс 2,5 %) из расчета 2 мл/кг клубней (по действующему веществу — 10 мг/кг). В контроле вместо препаратов использовали воду. Клубни просушивали на воздухе и укладывали в ящики.

Результаты подвергали статистической обработке с помощью пакета программ Microsoft Excel (11).

Результаты. На 3-и сут после начала опытов доля здоровых растений картофеля в контроле составила 22,2 %. Растений с оценкой степени поражения 1 балл оказалось 20,4 %, 2 балла — 22,0 %, 3 балла — 12,5 %, 4 балла — 18,8 % и 5 баллов — 4,2 % (табл. 1).

1. Показатели развития фитофтороза на растениях картофеля сорта Невский через 3 и 7 сут после антифунгальной обработки в полевых условиях (естественный инфекционный фон) (Х±х, Биологическая станция по выращиванию картофеля, пос. Охотничий, Ульяновская обл., 2004-2007 годы)

Вариант опыта

Доля растений (по степени поражения в баллах от 0 до 5), %

на 3-и сут

на 7-е сут

0

1

2

3

4

5

0

1

2

3

4

5

Контроль

22,2±3,2

20,4±2,9

21,9±3,1

12,5±1,8

18,8±2,7

4,2±0,6

2,6±0,4

12,8±1,8

7,7±1,1

20,5±2,9

20,5±2,9

35,9±5,1

Обработка:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

δ-эндоток-син

38,5±5,5

15,6±2,2

18,3±2,6

18,0±2,6

9,5±1,4

0

8,4±1,2

6,4±0,9

30,2±4,3

17,5±2,0

20,6±2,9

17,0±2,4

метамил

25,0±3,6

20,8±2,9

31,5±4,5

7,4±1,1

9,3±1,3

6,0±0,7

4,2±0,6

20,2±2,9

15,3±2,2

8,3±1,2

13,8±1,9

38,3±5,5

δ-эндоток-син + метамил

74,5±10,6

25,5±3,6

0

0

0

0

48,3±6,9

36,6±5,2

15,1±2,2

0

0

0

ридомил

60,6±4,3

18,4±2,5

14,1±2,2

6,9±1,0

0

0

16,2±3,1

25,7±2,6

21,3±1,3

9,7±1,0

15,5±2,0

11,6±2,2

НСР05

19,0

8,7

8,9

4,9

4,9

1,4

10,4

9,3

8,9

5,9

6,7

11,6

 Через 7 сут число растений без признаков поражения уменьшилось в 9 раз, тогда как с высоким (от 3 до 5) баллом поражения — увеличилось более чем вдвое, то есть наблюдалось явное развитие фитофтороза. Растений с поражением 3, 4 и 5 баллов стало больше соответственно на 8,0; 11,8 и 31,8 %.

При применении раствора δ-эндотоксина также отмечали снижение доли непораженных растений, но значительно меньшее, чем в контроле (в 1,7 раза через 3 сут и в 3,2 раза — через 7 сут). Одновременно уменьшалась доля растений с поражением по сравнению с контролем: для 1, 2, 3, 4 и 5 баллов через 3 сут — соответственно на 22,2; 17,5; 11,1; 15,9 и 3,2 %, через 7 сут — на 30,2; 17,5; 20,4; 6,4 и 17,5 %. 

Химический препарат ридомил сдерживал развитие заболевания несколько слабее, чем δ-эндотоксин. Так, число здоровых растений через 3 сут оказалось в 1,6 раза больше, чем при обработке δ-эндотоксином, через 7 сут — в 1,9 раза больше. Однако следует отметить, что норма его расхода была значительно выше. У метамила (аналог ридомила) эффект оказался ниже, чем у δ-эндотоксина: доля непораженных растений через 3 сут была в 1,1 раза больше, чем в контроле, через 7 сут — в 1,6 раза больше. Использование метамила позволило значительно сократить лишь число растений с поражением 3 и 4 балла (соответственно до 7,4 и 9,3 % через 3 сут и до 8,3 и 13,8 % через 7 сут) (см. табл. 1). Следует отметить, что обработка растений этим химическим фунгицидом практически не подавляла фитофтороз, и динамика развития болезни была схожа с таковой в контроле. 

Наиболее эффективное сдерживание развития болезни наблюдали при совместном использовании δ-эндотоксина с метамилом. При этом по сравнению с контролем доля непораженных растений возрастала в 3,4 раза через 3 сут и в 2,2 раза — через 7 сут. Полностью отсутствовали растения с 3-5-балльным поражением. Число слабопораженых (1-2 балла) было выше контрольного в 1,3 раза. Снижение доли здоровых растений на 7-е сут относительно 3-х (на 26,2 %) произошло только за счет растений с поражением 1 балл и появления 15,1 % растений со степенью поражения 2 балла. Растений без внешних признаков поражения оказалось в 19,0 раз больше, чем в контроле, и в 11,6 раза — чем при использовании метамила.

Анализ динамики распространенности болезни (P) свидетельствует, что в контрольной группе на 3-и сут показатель составил 77,8 %, на 7-е — уже 97,4 % (табл. 2), при обработке метамилом — оставался практически на уровне контроля (соответственно 75,0 и 95,8 %,), при использовании δ-эндотоксина — соответственно 61,5 и 91,6 %.

2. Показатели эффективности антифунгальных препаратов на растениях картофеля сорта Невский через 3 и 7 сут после обработки в полевых условиях (естественный инфекционный фон) (X±x, Биологическая станция по выращиванию картофеля, пос. Охотничий, Ульяновская обл., 2004-2007 годы)

Вариант опыта

Распространенность болезни, %

Биологическая эффективность, %

3-и сут

7-е сут

3-и сут

7-е сут

Контроль

77,8±11,1

97,4±13,9

8,7±1,3

18,4±2,6

Обработка:
δ-эндотоксин

61,5±8,8

91,6±13,1

23,5±3,4

19,9±2,9

метамил

75,0±10,7

95,8±13,7

10,8±1,5

8,3±1,2

δ-эндотоксин + метамил

25,5±3,6

51,7±7,4

35,5±5,1

52,4±7,5

НСР05

26,7

36,3

9,5

12,6

Совместное применение δ-эндотоксина и метамила позволило сдерживать развитие болезни в наибольшей степени: распространенность поражения на 3-и и 7-е сут оказалась соответственно на 52,3 и 45,7 % ниже, чем в контроле. Биологическая эффективность у δ-эндотоксина (степень поражения) была в 2,2 (3-и сут) и 2,4 раза (7-е сут) выше, чем у метамила (см. табл. 2). Можно предположить, что это связано с привыканием P. infestans к химическому препарату. На 7-е сут эффективность δ-эндотоксина несколько снизилась по отношению к показателю на 3-и сут и оказалась равной 19,9 %. Наиболее эффективным было совместное применение метамила с δ-эндотоксином (52,4 % на 7-е сут).

Типичные примеры растений из различных вариантов опыта представлены на рисунке 1. У контрольных больных растений была поражена вся листовая масса куста, на листьях — крупные некрозы различной формы, расплывчатые, коричневато-бурые с более светлым окаймлением. Клубней мало, при этом они мелкие. В варианте с метамилом такой вид имели


Рис. 1. Внешний вид растений картофеля (искусственный инфекционный фон, фаза клубнеобразования, начало августа) при ан-тифунгальной обработке: 1 — δ-эндотоксин с метамилом; 2 — контроль; 3 — δ-эндотоксин (Биологическая станция по выра-щиванию картофеля, пос. Охотничий, Ульяновская обл., 2004-2007 годы).

около 60 % кустов. При обработке δ-эндотоксином и метамилом соответственно у 60 и 40 % растений характерные симптомы отмечали обычно на нижней стороне нижних ярусов листьев, а основная листовая масса не была поражена. Сочетание δ-эндотоксина и метамила способствовало нормальному развитию ботвы и повышению урожая — формировалось большое число крупных клубней (в варианте с δ-эндотоксином и особенно с метамилом число клубней и масса клубня снижались).

Через 1 мес хранения картофеля сорта Ресурс наибольший защитный эффект давал химический препарат максим; достоверные результаты были получены и для δ-эндотоксина. При этом отмечали прямо пропорциональную зависимость величины эффекта от количества δ-эндотоксина: в дозе 7,5 мг/кг он снижал число пораженных клубней в 2,3 раза, в дозе 15 мг/кг — в 3,6 раза по сравнению с контролем (для химического препарата регистрировали 9-кратное снижение). На сорте Ильинский для δ-эндотоксина эти показатели составили соответственно 2,1 и 2,6 (у препарата максим эффективность была ниже, чем у δ-эндотоксина, во всех изученных концентрациях) (рис. 2, А).


Рис. 2. Сохранность клубней после хранения в течение 1 мес (А) и 3 мес (Б) у сортов картофеля Ресурс (а) и Ильинский (б) при антифунгальной обработке: 1 — контроль, 2-4 — δ-эндотоксин Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis (в дозах соответственно 7,5; 10,0 и 15,0 мг/кг), 5 — максим (10 мг/кг по д.в.) (Биологическая станция по выращиванию картофеля, пос. Охотничий, Ульяновская обл., 2004-2007 годы).

Через 3 мес хранения доля пораженных клубней картофеля у сорта Ресурс в контроле возросла в 2,2 раза относительно отмеченной через месяц (см. рис. 2, Б). Применение δ-эндотоксина обеспечило ее снижение в 1,5 (7,5 мг/кг) и 2,9 (15 мг/кг) раза, использование химического препарата максим — в 5,7 раза; у сорта Ильинский в контроле показатели соответственно увеличились в 2,1 раза, при обработке δ-эндотоксином — снизились в 1,6 и 1,8 раза (7,5 и 15 мг/кг), химическим препаратом максим — достоверно не отличались от зарегистрированных в варианте с δ-эндотоксином. Таким образом, смеси, содержащие очищенный δ-эндотоксин B. thuringiensis subsp. thuringiensis, эффективнее сдерживают развитие и распространение фито-фтороза на растениях сорта Невский в полевых условиях, чем химический препарат метамил. При хранении δ-эндотоксин также успешно ограничивает развитие заболевания клубней: эффективность δ-эндотоксина и препарата максим соизмерима, при этом следует подчеркнуть, что последний чрезвычайно токсичен (использование в пищевых целях обработанной им продукции недопустимо), а δ-эндотоксин признан безопасным для здоровья человека и животных.

Отметим, что возможность сдерживания заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами, с помощью культур B. thuringiensis, содержащих спорокристаллические комплексы, была известна ранее (3, 4). Однако применение в защитных мероприятиях препаратов, содержащих живые бактериальные клетки, предполагает интродукцию микроорганизмов в агроценозы, что экологически нежелательно.

Итак, показана возможность использования выделенного и очищенного δ-эндотоксина Bacillu sthuringiensis subsp. thuringiensis для защиты картофеля от фитофтороза в период вегетации и хранения.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. B r a v o  A. Phylogenetic relationships of Bacillus thuringiensis δ-endotoxin family proteins and their functional domains. J. Bacteriol., 1997, 179(9): 2793-2801.
2. K n o w l e s  B.H. Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal δ-endotoxin. Adv. Insect. Phys., 1994, 24: 275-303.
3. К а н д ы б и н  Н.В.,  С м и р н о в  О.В. О создании микробных препаратов с полифункциональными свойствами. Агро XXI, 1999, 9: 11.
4. Г р и ш е ч к и н а  С.Д.,  С м и р н о в  О.В.,  К а н д ы б и н  Н.В. Фунгистатическая активность различных подвидов Bacillus thuringiensis. Микол. и фитопатол., 2002, 36(1): 58-62.
5. Т ю л ь п и н е в а  А.А. Действие δ-эндотоксина B. thuringiensis в отношении ряда фитопатогенных грибов. Канд. дис. Ульяновск, 2003.
6. К а м е н е к  Л.К.,  Л е в и н а  Т.А.,  П а н т е л е е в  С.В.,
Т е р ё х и н  Д.А.,  М и н а ч е в а  Л.Д. Об устойчивости растений овса к бурому бактериозу под влиянием d-эндотоксинов Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. С.-х. биол., 2006, 1: 98-107.
7. К а м е н е к  Л.К.,  Л е в и н а  Т.А.,  Т е р е х и н  Д.А.,  М и н а ч е в а  Л.Д. Антибактериальное действие d-эндотоксина Bacillus thuringiensis как потенциального агента защиты растений. Биотехнология, 2005, 1: 59-67.
8. C o o k s e y  K.E. Purification of a protein from Bacillus thuringiensis toxic to larvae of Lepidoptera. Biochem. J., 1968, 106: 445-454.
9. В л а с о в а  Э.А. Методы фитопатологических и энтомологических исследований в селекции растений /Под ред. Ю.Н. Фадеева, А.А. Кузьмичева. М., 1977.
10. Т в е р д ю к о в  А.П. Биологический метод борьбы с вредителями и болезнями в защищенном грунте. М., 1993.
11. Д о с п е х о в  Б.А. Методика полевого опыта. М., 1985.

 

ANTIFUNGAL EFFECT OF Bacillus thuringiensis δ-ENDOTOXIN IN RELATION TO LATE BLIGHT DISEASE OF POTATO IN THE FIELD CONDITIONS AND STORAGE

L.K. Kamenek, T.A. Satarova, D.V. Kamenek, M.A. Terpilovskii

The effect of various doses of δ-endotoxin of Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis on late blight disease of potato of Nevskiy, Resurs and Ilyinskiy cultivars was assessed in the field (natural infectional background) and storage conditions with determination simultaneously a degree of late blight disease spreading and a degree of damaging action on plants and tubers. δ-endotoxin has a significant effect upon the development of disease, comparable with that of standard chemical fungicides (metamil, ridomil, maxim).

Keywords: natural plant protection, late blight, antifungal activity, Bacillus thuringiensis delta endotoxins.

ФГОУ ВПО Ульяновский государственный
университет,

432970 г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42,
e-mail: kameneklk@mail.ru

Поступила в редакцию
27 января 2010 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало