БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ

ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ

ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ

КАРТА САЙТА

НА ГЛАВНУЮ

Сельскохозяйственная биология, 2009, № 1, с. 93-98.

УДК 635.63:578.865.1:631.524.82

РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ ОГУРЦА, ЗАРАЖЕННЫХ ВИРУСОМ ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ, ПРИ ОБРАБОТКЕ ФЛАВОНОИДСОДЕРЖАЩИМИ КОНЦЕНТРАТАМИ

О.Э. ОРАЗОВ, В.С. НИКИТИНА

В условиях защищенного грунта изучали биологическое действие флавоноидсодержащих концентратов (СФК), выделенных из герани луговой (Geranium pratense L.), на развитие растений огурца (Cucumis sativus L.) сорта Изящный при заражении обычным штаммом вируса табачной мозаики (ВТМ). Выявлено подавление системной вирусной инфекции при поливе под корень и особенно при опрыскивании листьев, а также более раннее плодоношение у здоровых растений по сравнению с инфицированными, но не обработанными СФК.

Ключевые слова: суммарные флавоноидсодержащие концентраты, вирус табачной мозаики, системная вирусная инфекция, иммунизация, герань луговая, огурец.

 

Показано, что экзогенные природные фенольные соединения вызывают в растениях различные ростовые и биохимические эффекты (1, 2). Наиболее изучено воздействие фенольных соединений на ризогенез черенков. Фенольные соединения могут регулировать уровень эндогенного ауксина через ферментные системы синтеза и распада индолилуксусной кислоты (ИУК) (3, 4). Совместное влияние на укоренение и рост побегов садовых растений оказывали также флоридзин и индолилмасляная кислота (ИМК) (5). Синтетический полифенол ионол (ВНТ) снижал количество образуемого супероксида O^2- , подавлял рост, увеличивал продолжительность жизни колеоптиля, а также предупреждал появление признаков старения и апоптоза у этиолированных проростков пшеницы (6).

При изучении антифитовирусного действия природных полифенолов и флавоноидов было показано (7), что 3,7,4'-триметилкверцетин (айанин) и 3,7,3,4-тетраметилкверцетин при предварительной инкубации вируса табачной мозаики (ВТМ) в их растворах подавляют его развитие после инокуляции растений Nicotiana gluticosa. Тетраметилкверцетин формировал устойчивый комплекс с вирионами и снижал инфекционность на N. gluticosa. Предполагается, что специфически метилированные соединения кверцетина снижают инфекционность ВТМ посредством ослабления связей между субъединицами вириона (отделение белковой оболочки), вследствие чего вирусная РНК подвергается атаке РНКазы хозяина при механической инокуляции. Инфекционность Х-вируса картофеля (ХВК) в Chenopodium quinoa существенно ингибировалась низкими концентрациями кверцетина, морина и 3-O-метилгалангина (8). Авторы считают, что кверцетин и его производные препятствуют взаимодействию белка ХВК с рецепторами хозяина, необходимыми для развития инфекции. При смешивании раствора флавоноидов с суспензией неповируса пятнистости томатов ингибировалась инфекционность инокулюма для растений C. quinoa (9).

По отношению к фитовирусам эффективны смеси флавоноидов, а также их производных. Это было показано для яблоневого вируса стеблевых выемок, титр которого снижался при воздействии омбуина (7,4-диметилкверцетина) в меньшей степени, смесей глицирризин+кверцетин и кверцетин+рибовирин — в большей. Последнее сочетание эффективно элиминировало вирус стеблевых выемок яблони в растениях N. occidentalis и Malus domestica в опытах in vivo(10).

В ранее проведенных экспериментах нами показано, что водорастворимый комплекс полифенольных соединений из герани луговой Geraniumpratense в концентрации 0,05-0,10 % при опрыскивании листьев способен подавлять системное заражение растений огурца Cucumissativus, однако предпосевная обработка семян не обеспечивает защиту от вирусной инфекции (11).

Некоторые сорта огурца в условиях защищенного грунта подвержены заболеваниям, вызываемым вирусами и фитопатогенными микроорганизмами, что приводит к существенным потерям урожая и актуализирует поиск антифитовирусных агентов. Преимущество препаратов природного происхождения по сравнению с химикатами (помимо низкой токсичности для растений и человека) заключается в том, что они менее мутагенны (и, соответственно, в меньшей степени вызывают образование новых штаммов вирусов) при более широком спектре действия (12). Однако их влияние на биохимический статус и развитие культурных растений исследовано недостаточно.

Цель представленной работы — изучение биологического действия флавоноидсодержащих концентратов, выделенных из надземной части герани луговой Geranium pratense L., на растения огурца, инфицированные ВТМ.

Методика. В работе в качестве модельного использовали сорт огурца Изящный, растения которого в предварительных испытаниях показали повышенную чувствительность к воздействию ВТМ. Опыты проводили на светоплощадке (освещенность 8 кЛк, 14-часовой фотопериод). Растения высаживали в пластиковые стаканчики с почвогрунтом фирмы «Terra Vita» (Россия). Опытные образцы разделяли на 4 группы (по 10 растений в каждой): I — неинфицированный контроль, II — инфицированные ВТМ, но не обработанные фитопрепаратами, III — инфицированные после полива под корень 0,05 % раствором флавоноидсодержащих концентратов в течение 10 сут до заражения, IV — инфицированные ВТМ после опрыскивания листьев тем же раствором однократно за 4 сут до заражения. Полив обессоленной водой (I, II и IV группы) или 0,05 % раствором суммарных флавоноидсодержащих концентратов (СФК) (III группа) проводили через каждые 48 ч в дозе 30 мл на одно растение, опрыскивание растений IV группы — в дозе 30 мл того же раствора. Дополнительно растения всех групп подкармливали средой Хогланда-Арнона с микроэлементами 1 раз в 4 сут в дозе 20 мл. Эксперимент выполняли в 2 повторностях.

Суммарные флавоноидсодержащие концентраты выделяли из надземной части дикорастущей герани луговой (G. pratense L.) (13). Измельченное воздушно-сухое растительное сырье обрабатывали кипящим хлороформом в соотношении 20:1 (объем к массе) для очистки от липофильных примесей. Фенольные соединения 2-кратно экстрагировали кипящим 70 % этанолом (25:1). Спиртовые фракции объединяли, лиофилизировали и промывали холодной водой (3-4 °С) для удаления примесей сопутствующих веществ, остаток повторно лиофилизировали. Сухие экстракты фенольных соединений представляют собой кристаллический порошок светло-коричневого цвета, хорошо растворимый в горячей воде, водных растворах ацетона, метанола, этанола и в лимоннокислом буфере (рН 2,2). В препарате 65-70 % от общей массы составляли флавоноиды (из групп флавонов, флавонолов и антоцианов), фенилпропаноиды и конденсированные фенольные соединения (по данным качественных реакций, а также разделения с помощью тонкослойной и жидкостной колоночной хроматографии), 2-3 % — гидроксикоричные кислоты (их содержание определяли экстракционно-спектрофотометрически) (14). Суммарное содержание полифенольных соединений измеряли колориметрически с использованием реактива Фолина-Дениса (15). Количество флавоноидов определяли по методике, основанной на реакции комплексообразования с хлоридом алюминия, в пересчете на стандартные промышленные препараты — ди-гликозид рутина или агликон кверцетина (16).

Для обработки растений готовили водные растворы СФК (концентрация действующих веществ 0,01-0,10 % по массе).

Развитие вирусной инфекции регистрировали визуально и с помощью светового микроскопа Бимам Р 13 («Ломо», Россия) через 2 и 7 сут после инфицирования по образованию некрозов на листьях.

Для оценки репаративного действия экзогенных полифенолов на клеточные органеллы и регенерационных процессов в мезофилле зараженных ВТМ листьев огурца использовали модифицированный метод введения раствора люминесцирующего красителя флуоресцеина (17). Высечки листа размером 5´5 мм обрабатывали 2 % раствором флуоресцеина в 5 % уксусной кислоте. Через 5 мин промывали 5 % CH₃COOH и помещали на предметное стекло. Препараты просматривали в люминесцентном микроскопе Люмам Р 8 («Ломо», Россия) через оранжевый светофильтр, подсчитывая ярко-зеленые флуоресцирующие зоны.

Полученные данные подвергали статистической обработке с помощью программы Statistica v. 4.0 («StatSoft», США).

Рис. 1. Проявление системной инфекции на листьях огурца сорта Изящный при заражении вирусом табачной мозаики (ВТМ): А и Б — фрагменты зараженного листа через 2 сут после инокуляции ВТМ соответственно без обработки и после однократного опрыскивания (за 4 сут до инфицирования) флавоноидсодержащими концентратами, выделенными из герани луговой.

Результаты. При обработке поливом под корень и однократном опрыскивании листьев последнее оказалось наиболее эффективным (рис. 1).

Развитие системного поражения растений огурца ВТМ наблюдалось на 2-е сут после инокуляции как множественная мозаичность листьев; через 5 сут число некротических пятен практически не изменялось (табл. 1).

 

 

 

 

1. Число некротических пятен на половине листа у зараженных вирусом табачной мозаики растений огурца сорта Изящный в защищенном грунте при разных вариантах обработки флавоноидсодержащими концентратами из герани луговой (Х±х)
Группа	2-е сут		7-е сут
	1	2	1	2
II (n = 10) (контроль)	104±15	89±11	110±10	92±6
III (n = 10)	20±4	15±5	4±1	0
IV (n = 10)	3±1	0	0	0
П р и м е ч а н и е. Описание групп по вариантам обработки см. в разделе «Методика»; 1 и 2 — повторности опыта.

Внесение СФК под корень или опрыскиванием (соответственно III и IV группа растений) в сочетании с подкормкой существенно подавляло развитие инфекции ВТМ (вплоть до отсутствия видимых проявлений), причем во втором варианте — в несколько большей степени (см. табл. 1). Через 7 сут у иммунизированных СФК растений огурца в III группе наблюдалась репарация пораженных участков листьев.

Между растениями разных групп были видны различия по скорости развития и приросту надземных органов (рис. 2). У инфицированных ВТМ растений после появления признаков заболевания (пятнистость, некрозы) замедлялся рост побегов, листьев и в последующие 7 сут формировались только мужские цветки («пустоцветы»), пигментация листьев и побегов также частично нарушалась. Образование завязей задерживалось на 5-6 сут, и в дальнейшем около 40 % из них не развивалось (табл. 2).

Рис. 2. Влияние экзогенных флавоноидсодержащих концентратов (СФК), выделенных из герани луговой на развитие растений огурца сорта Изящный, инфицированных вирусом табачной мозаики: А — инфицированное растение после однократного опрыскивания раствором СФК, Б — здоровое растение того же возраста (фаза 4-го листа).

При люминесцентной микроскопии с использованием высечек листьев было установлено, что через 7 сут после опрыскивания СФК у растений из II и IV групп окраска пораженных зон (хлоротичные участки с множественными пятнами мозаики) изменялась на более темную, что указывало на восстановление пластидных элементов клетки. Число некротических пятен заметно уменьшалось (не менее чем на 60 %). Кроме того, частично восстанавливались разрушенные клеточные стенки, о чем свидетельствовало затрудненное вымывание флуоресцеина (известно, что этот краситель свободно проникает в клетку как через поврежденную, так и через нативную клеточную стенку и плазмалемму, однако в первом случае он так же легко вымывается 5 % уксусной кислотой, во втором — частично задерживается). Через 14 сут большинство инфицированных листьев растений практически не отличалось от листьев контрольных неинфицированных (I группа).

 

 

 

 

 

Известно, что при вирусной инфекции в хлоропластах и митохондриях неиммунных растений происходят структурно-функциональные нарушения (18, 19), что приводит к замедлению развития и угнетению растений, становясь причиной низкой урожайности. По нашему мнению, развитие вирусной инфекции сопровождается образованием избыточного количества O^2-, что приводит к разрушению клеток. Обработка СФК устраняла этот токсический эффект, положительно сказывалась на общем биохимическом и функциональном статусе растений и, как следствие, стимулировала формирование побегов и генеративных органов. Возможно, экзогенные флавоноиды, которые известны как стимуляторы прорастания пыльцевых трубок (20, 21), принимали участие в развитии завязей.

Таким образом, опрыскивание листьев огурца сорта Изящный флавоноидсодержащими концентратами (СФК), выделенными из герани луговой, служит эффективным способом профилактики инфекции, вызываемой обычным штаммом вируса табачной мозаики (ВТМ). На начальных этапах заражения проведенное однократно за 4 сут до инфицирования опрыскивание листьев способствует подавлению инфекции с частичной регенерацией поврежденных участков и восстановлением пигментации листьев. При этом значительно ускоряется генеративное развитие и формирование полноценных плодов у обработанных СФК растений по сравнению с интактными. Полученные данные позволяют считать флавоноидсодержащие концентраты из надземной части герани луговой перспективными при создании фитопрепаратов-иммуномодуляторов для восприимчивых к ВТМ культурных растений.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. М и н а е в а  В.Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование. Новосибирск, 1978.
2. В о л ы н е ц  А.П. Взаимодействие эндогенных регуляторов роста и гербицидов. Минск, 1980.
3. З а п р о м е т о в  М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения. В сб.: 56-е Тимирязевские чтения. М., 1996: 45-47.
4. Т р у ш е ч к и н  В.Г.,  П о л и к а р п о в а  Ф.Я.,  Я к о в л е в а  В.А. О влиянии некоторых фенольных соединений на корнеобразование и прирост зеленых черенков клонового подвоя яблони Парадизка краснолистная. В сб.: Плодоводство и ягодоводство Нечерноземной полосы. М., 1975, т. 8: 181-188.
5. У п а д ы ш е в  М.Г.,  Д р о з д о в с к и й  Э.М. Об использовании флоридзина при микроразмножении садовых растений. С.-х. биол., 2003, 1: 87-92.
6. В а н ю ш и н  Б.Ф.,  А л е к с а н д р у ш к и н а  Н.И.,  З а м я т н и н а  В.А. Фенольные соединения в системе регуляции апоптоза, клеточной дифференцировки, роста и развития растений. Тез. докл. VI симп. по фенольным соединениям. М., 2004: 17-18.
7. F r e n c h  C.J.,  E l d e r  M.,  L e g g e t t  F. e.a. Flavonoids inhibit infectivity of tobacco mosaic virus. Canadian J. Plant Pathol., 1991, 13: 1-6.
8. F r e n c h  C.J.,  T o w e r s  G.H.N. Inhibition of infectivity of potato virus X by flavonoids. Phytochemistry, 1992, 31(9): 3017-3020.
9. M a l h o t r a  B.,  O n y i l a g h a  J.C.,  B o h m  B.A. e.a. Inhibition of tomato ringspot virus by flavonoids. Phytochemistry, 1996, 43: 1271-1276.
10. J a m e s  D.,  T r y t t e n  P.A.,  M a c k e n z i e  D.J. e.a. Elimination of apple stem grooving virus by chemotherapy and development of an immunocapture RT-PCR for rapid sensitive screening. Ann. Appl. Biol., 1997, 131(3): 459-470.
11. О р а з о в  О.Э.,  Н и к и т и н а  В.С. Экстракты растительных фенольных соединений в защите восприимчивых сортов огурца от вируса табачной мозаики. Биотехнология, 2005, 4: 67-69.
12. J a s s i m  S.A.A.,  N a j i  M.A. Novel antiviral agents: a medicinal plant perspective. J. Appl. Microbiol., 2003, 95(3): 412-427.
13. Н и к и т и н а  В.С.,  О р а з о в  О.Э.,  Ш е н д е л ь  Г.В. Эколого-биохимические особенности накопления биологически активных веществ в некоторых видах сем.14. Geraniaceae на Южном Урале. Сибирский экологический журнал, 2004, 6: 825-834.
15. К о с м а н  В.М.,  З е н к е в и ч  И.Г. Количественное экстракционно-спектрофото-метрическое определение суммарного содержания гидроксикоричных кислот в присутствии флавоноидов в экстрактивных веществах некоторых лекарственных растений. Раст. ресурсы, 2001, 37: 123-129.
16. З а п р о м е т о в  М.Н. Фенольные соединения и методы их исследования. В сб.: Биохимические методы в физиологии растений. М., 1971: 185-208.
17. К у ц ы к  П.Г.,  Р ы б а ч е н к о  А.И.,  В о л о в и к  В.Г. и др. Спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов и флавоноидных гликозидов в корневищах и корнях шлемника Байкальского. Хим.-фарм. журн., 1994, 4: 45-47.
18. Г и б б с  А.,  Х а р р и с о н  Б. Основы вирусологии растений. М., 1978.
19. Л а д ы г и н а  М.Е.,  Б а л н о к и н а  Ю.В., Электронно-микроскопическая характеристика энергетических центров табака в связи с иммунитетом к вирусу табачной мозаики. В сб.: Физиология и биохимия здорового и больного растения. М., 1970: 331-348.
20. Б у т о р я н у  В.В. Особенности реакций растения-хозяина в ответ на вирусные инфекции. В сб.: Вирусные заболевания культурных растений Молдавии. Кишинев, 1984: 32-57.
21. Y l s t r a  B.,  T a u r a e v  A.,  M o r e n o  R.M.B. e.a. Flavonols stimulate development, germination and tube growth of tobacco pollen. Plant Physiol., 1992, 100(3): 902-907.
22. V o g t  T.,  W o l l e n w e b e r  E.,  T a y l o r  L.R.  The structural reguirements of flavonols that induce pollen germination of conditionally male fertile Petunia. Phytochemistry, 1995, 38(3): 589-592.

 

DEVELOPMENT OF THE CUCUMBER PLANTS INFECTED BY TOBACCO MOSAIC VIRUS AFTER THEIR TREATMENT BY FLAVONOID-BEARING CONCENTRATES

O.E. Orazov, V.S. Nikitina

In the conditions of covered soil the authors studied the biological effect of flavonoid-bearing concentrates (FBC) isolated from Geranium pratense L. on the development of cucumber (Cucumis sativus L.) plants of the Izyashchnyi variety. It was revealed that root watering and leaf sparge, especially, by FBC promote to inhibition of systemic infection into plants induced by ordinary strain of tobacco mosaic virus. The authors revealed also that healthy plants bear harvest sooner than infected plants but untreated by FBC.

Key words: total flavonoid concentrates, tobacco mosaic virus, system virus infection, immu-nization, Geranium meadow, cucumber.

 

ФГОУ ВПО Башкирский государственный университет, 450002 г. Уфа, ул. З. Валиди, 32, e-mail: orazov@mail.ru, nikvalent@mail.ru

Поступила в редакцию 25 июля 2006 года

 

Оформление электронного оттиска

От эксперимента — к практике Всероссийский НИИ селекции и семеноводсва овощных культур Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Всероссийский НИИ cельскохозяйственной биотехнологии РАСХН Биотехнический научно-экспериментальный комплекс "ГосНИИсинтезбелок"