БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ

ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ

ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ

КАРТА САЙТА

НА ГЛАВНУЮ

Сельскохозяйственная биология, 2009, № 1, с. 77-82.

УДК 633.31:631.461.5:631.52

ИЗМЕНЧИВОСТЬ ШТАММОВ Sinorhizobium meliloti ПО ПРИЗНАКАМ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИМ САПРОФИТНУЮ ВЫЖИВАЕМОСТЬ И СИМБИОТИЧЕСКУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ

О.П. ОНИЩУК, М.Л. РУМЯНЦЕВА, Н.А. ПРОВОРОВ, Б.В. СИМАРОВ

Клубеньковые бактерии люцерны (Sinorhizobium meliloti) из китайской и сибирской почвенных популяций изучали по ряду признаков, важных для сапрофитного существования, и симбиотическим свойствам, проявляемым при отсутствии или внесении 0,6 % NaCl в среду для выращивания люцерны посевной (Medicago sativa). Выявлены достоверные различия между популя-циями по составу полисахаридов, продукции меланина и антибиотикоустойчивости бактерий. В популяциях выделено по одному штамму, формирующему эффективный симбиоз с люцерной при засолении. В микровегетационных опытах показано, что генетическое варьирование штаммов ризобий не менее существенно влияет на эффективность симбиоза, чем солевой стресс, негативное воздействие которого на растения, следовательно, может быть преодолено с помощью селекции микросимбионтов.

Ключевые слова: клубеньковые бактерии, люцерна, солевой стресс, эффективность симбиоза, криптические плазмиды, устойчивость к антибиотикам.

 

Клубеньковые бактерии (ризобии) могут существовать в двух состояниях — сапрофитном (при отсутствии растения-хозяина) и симбиотическом (в клубеньках бобовых растений). В связи с ухудшающимся состоянием многих почв важно выявить влияние эдафических стресс-факторов (например, засоления) на проявление симбиотической эффективности штаммов ризобий. Известно, что cолевой стресс приводит к нарушениям в формировании симбиоза на разных этапах — деформации корневых волосков, образования инфекционных нитей, развития клубеньков и дифференцировки бактероидов (1-3). В то же время некоторые штаммы клубеньковых бактерий сохраняют способность к размножению при концентрациях NaCl (2,0-4,0 %), полностью ингибирующих развитие макросимбионта (1, 4, 5). Поэтому инокуляция бобовых, например люцерны, клубеньковыми бактериями (Sinorhizobium meliloti) может быть решающим фактором выживания растений в условиях солевого стресса (5).

С целью разработки подходов для получения таких микросимбионтов мы изучили изменчивость штаммов S. meliloti, выделенных из почв двух географически удаленных регионов Азии (Сибирь и Китай), по признакам, влияющим на сапрофитную выживаемость, взаимосвязь этих признаков с симбиотическими свойствами ризобий (клубенькообразование, эффективность) в условиях засоления, а также вклад генотипических (варьирование штаммов S. meliloti) и средового (засоление) факторов в формирование эффективного симбиоза S. meliloti—Medicagosativa в условиях микровегетационных опытов.

Методика. Объектом исследования служили изоляты S. meliloti из почвенных популяций: 18 КП-штаммов (Китай) (коллекция д-ра K. Линдстрем, Финляндия) и 16 СК-штаммов (Сибирь, Иркутская обл.) (коллекция Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии— ВНИ-ИСХМ) (6). Бактерии выращивали в жидкой или на агаризованной (2 %) среде TY (7).

В качестве культурально-биохимических признаков клубеньковых бактерий, существенно влияющих на их сапрофитную выживаемость (8), изучали продукцию липо- и экзополисахаридов, устойчивость к антибиотикам, а также синтез меланина.

Интенсивность продукции поверхностных полисахаридов у ризобий оценивали на агаризованной среде 79 (9), синтеза экзополисахаридов (ЭПС) — при выращивании штаммов на агаризованной минимальной среде (10) с калькофлуором (0,02 %). Изменчивость свойств липополисахаридов (ЛПС) и ЭПС выявляли на агаризованной среде LB с дезоксихолатом натрия (0,01 %) (11), а также по окраске колоний на минимальной среде с конго красным (0,02 %) (11). Способность штаммов продуцировать меланин определяли согласно стандартной методике (12). Антибиотикоустойчивость штаммов оценивали по росту на твердой среде TY, содержащей стрептомицин (Sm) — 200-300; канамицин (Km) — 200; ампициллин (Ap) — 200; хлорамфеникол (Cm) — 100; рифампицин (Rf) — 50-100 мг/л. Солеустойчивость ризобий определяли по росту на твердой среде TY, содержащей 0,6 или 0,7 М NaCl (5), с использованием высокоэффективного лабораторного штамма СХМ1-105 S. meliloti в качестве стандарта (13).

Плазмидный состав штаммов S. meliloti анализировали модифицированным методом Экхардта при сравнении с типовым штаммом МVII S. meliloti, который содержит мегаплазмиды SMa и SMb (соответственно 1300 и 1700 т.п.н.), а также плазмиды меньшего размера (152, 135, 81 и 56 т.п.н.) (14).

Симбиотические свойства ризобий определяли в условиях стерильных микровегетационных опытов с люцерной посевной (Medicagosativa, сорт Вега) (13). Эффективность симбиоза оценивали по изменению сухой массы растений относительно полученной в вариантах без инокуляции либо с инокуляцией штаммом СХМ1-105. Устойчивость симбиозов S. me-liloti—M. sativa к засолению изучали при выращивании растений на полужидкой (0,7 %) среде Красильникова-Кореняко с 0,6 % NaCl (5). Математическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента, метода χ2, корреляционного и двухфакторного дисперсионного анализа (15).

Результаты. На основании оценки роста колоний и их способности окрашиваться на диагностических средах изученные штаммы S. meliloti по каждому из анализируемых признаков разделили на контрастные группы, что позволило сравнить КП- и СП-популяции с использованием t-критерия Стьюдента (табл. 1). Оказалось, что у СП-штаммов интенсивность адсорбции красителя конго красного достоверно выше, чем у КП-штаммов, что указывает на различия в составе поверхностных полисахаридов у бактерий этих популяций (11). Однако на средах с дезоксихолатом натрия и калькофлуором все изученные штаммы имели сходные фенотипы (нормальный рост и свечение при воздействии УФ-лучами; данные не приводятся).

Сравниваемые популяции достоверно различались по способности синтезировать внеклеточный меланин: большинство КП-штаммов (61 %) обладало этим свойством, большинство СП-штаммов (75 %) — не обладало. Полученные результаты согласуются с данными о том, что штаммы, выделенные в южных регионах, часто продуцируют меланин, способствующий их выживанию в поверхностном слое почвы (16).

Подавляющее число штаммов в обеих популяциях было устойчиво к стрептомицину, канамицину, ампициллину и рифампицину. Вместе с тем КП-штаммы оказались более чувствительными к хлорамфениколу, чем СП-штаммы. По устойчивости к ампициллину между двумя популяциями проявились достоверные различия (см. табл. 1).

Большинство штаммов КП- и СП-популяций (соответственно 72 и 87 %) оказалось способно расти на агаризованной среде TY с высоким содержание NaCl (0,7 М, или 4,1 %), что согласуется с данными, полученными ранее для штаммов S. meliloti различного происхождения (1, 5).

У клубеньковых бактерий признаки, влияющие на сапрофитную выживаемость и симбиотические свойства, детерминируются генами, расположенными на хромосоме и двух симбиотических мегаплазмидах, а также на некоторых плазмидах меньшего размера (17-19).

Рис. 1. Распределение КП- и СП-штаммов Sinorhizobium melilotiпо числу криптических плазмид. Описание  КП- и СП-штаммов  (соответственно а и б) см. в разделе «Методика».

Анализ плазмидного состава штаммов показал, что примерно у половины имелось по одной криптической плазмиде (рис. 1), две либо три криптические плазмиды были обнаружены у 44 % КП- и 19 % СП-изолятов, 89 % КП- и 75 % СП-штаммов несли от одной до трех криптических плазмид размером 40-350 т.п.н. Всего выявили 11 различных наборов плазмид. При этом у большинства КП- (83 %) и СП-штаммов (62 %) были выявлены плазмиды, размеры которых варьируют от 140 до 200 т.п.н. Достоверных различий по составу плазмид между двумя популяциями не обнаружили (χ2 = 4,41; Р > 0,05).

В стерильных микровегетационных опытах прибавки сухой массы растений люцерны при инокуляции СП-штаммами (относительно контроля без инокуляции) были достоверно выше, чем при инокуляции КП-штаммами (табл. 2). При этом на 24-е сут после инокуляции КП-штаммы формировали на корнях люцерны достоверно большее число клубеньков, чем СП-штаммы (соответственно 6,38±0,59 и 4,29±0,51; Р0 < 0,05).

2. Оценка влияния солевого стресса на симбиотическую эффективность КП- и СП-штаммов Sinorhizobium meliloti(растения люцерны посевной сорта Вега, стерильный микровегетационный опыт)
Показатель	КП-штаммы	СП-штаммы
Сухая масса растений, прибавка к контролю без инокуляции на фонах: без NaCl с NaCl	+91,90±7,69 +1,20±5,30	+127,20±15,00* +8,20±6,08
Соотношение сухой массы растений на фонах с NaCl/без NaCl	0,680±0,037	0,640±0,044
П р и м е ч а н и е. Описание штаммов см. в разделе «Методика». * Различие между популяциями достоверно (Р0 < 0,05).

В условиях засоления масса растений и число клубеньков были значительно ниже, чем в бессолевых. Анализ суммарных данных выявил, что на фоне засоления прибавка сухой массы растений при инокуляции СП-штаммами была значительно больше, чем при инокуляции КП-штаммами, однако соотношение этого показателя у инокулированных растений в солевых и бессолевых условиях было сходным для СП- и КП-популяций (см. табл. 2). В вариантах с засолением было выявлено только два штамма (ВВ632 из КП- и SB261 из СП-популяции), инокуляция которыми обеспечивала достоверную прибавку сухой массы надземной части растений (на 36,6-38,4 % по отношению к контролю без инокуляции).

 

Рис. 2. Вклад генотипа КП- и СП-штаммовSinorhizobium meliloti и солевого стресса в общее варьирование сухой массы растений люцерны посевной в стерильном микровегетационном опыте (по данным двухфакторного дисперсионного анализа): а — генотип штаммов; б — солевой стресс; в — взаимодействие генотип—солевой стресс; г — другие факторы. Описание КП- и СП-штаммов см. в разделе «Методика».

В изученных популяциях у КП- и СП-изолятов не обнаружили достоверных взаимосвязей между симбиотической эффективностью, проявляемой при засолении и в бессолевых условиях (r = +0,21…+0,35; Р0 > 0,05). Однако была показана достоверная корреляция между симбиотической эффективностью и числом клубеньков, образованных КП-штаммами в присутствии NaCl (r = +0,65; Р0 < 0,01) и в бессолевых условиях (r = +0,48; Р0 < 0,05), что указывает на возможность использования этого признака для отбора эффективных штаммов. Признаки, связанные с сапрофитной выживаемостью бактерий, для целей селекции не подходят, так как их корреляция с симбиотической эффективностью штаммов не выявлена (данные статистической обработки не приведены).

При использовании двухфакторного дисперсионного анализа для количественной оценки вклада генотипов S. meliloti в определение эффективности симбиоза в условиях засоления (при этом общее варьирование показателя сухой массы растений, которое условно принимается за 100 %, раскладывают на составляющие, отражающие межштаммовые генотипические различия, влияние солевого стресса, а также взаимодействие этих факторов) оказалось (рис. 2), что вклад генотипов S. meliloti для СП-популяции выше, чем для КП-популяции, что указывает на большую генетическую разнородность СП-штаммов. Выявление эффекта взаимодействия генотипов штаммов с солевым стрессом свидетельствует, что генетические различия между штаммами по реакции на стресс (см. табл. 2) могут быть использованы для подбора штаммов, эффективных в условиях засоления.

Таким образом, для двух популяций Sinorhizobium meliloti, выделенных из почв в Китае и Сибири, установлена весьма значительная разнородность штаммов по признакам, которые могут играть важную роль в сапрофитном существовании бактерий в почвах (синтез поверхностных полисахаридов и меланина, устойчивость к антибиотикам). Особенности  проявления этих признаков, а также набора плазмид бактерий указывают на значительный генетический полиморфизм исследуемых популяций. Статистическая обработка данных микровегетационных опытов свидетельствует о существенном влиянии генетического варьирования штаммов ризобий по симбиотическим свойствам на эффективность симбиоза в условиях засоления, что создает возможность преодоления солевого стресса при подборе определенных генотипов микросимбионтов. Использование выявленных нами штаммов S. meliloti, обладающих симбиотической эффективностью в условиях засоления, может оказаться полезным при возделывании люцерны в условиях осмотического стресса и для фиторемидиации засоленных почв.

Авторы выражают признательность К. Линдстрем (университет г. Хельсинки) за предоставленную коллекцию КП-штаммов Sinorhizobiummeliloti и В.С. Беловой за помощь в постановке опытов.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Z a h r a n  H.H. Rhizobium-legume symbiosis and nitrogen fixation under severe conditions and in arid climate. Microbiol. Biol. Rev., 1999, 63(4): 968-989.
2. S w a r a j  K.,  B i s h n o i  N.R. Effect of salt stress on nodulation and nitrogen fixation in legumes. Ind. J. Exp. Bot., 1999, 37: 843-848.
3. F o u g e r e  F.,  L e  R u d u l I e r  D.,  S t r e e t e r  J.G. Effects of salt stress on amino acid, organic acid, and carbohydrate composition of roots, bacteroids, and cytosol of alfalfa (Medicago sativa L.). Plant Physiol., 1991, 96: 1228-1236.
4. Y a n  A.M.,  W a n g  E.T.,  K a n  F.L. e.a. Sinorhizobium meliloti associated with Medicago sativa and Melilotus spp. in arid saline soils in Xinjiang, China. Internat. J. System. Evolut. Microbiol., 2000, 50: 1887-1891.
5. И б р а г и м о в а  М.В.,  Р у м я н ц е в а  М.Л.,  О н и щ у к  О.П и др. Симбиоз клубеньковых бактерий Sinorhizobium meliloti с люцерной Medicagosativaв условиях засоления. Микробиология, 2006, 75(1): 94-100.
6. А н д р о н о в  Е.Е.,  Р у м я н ц е в а  М.Л.,  С а г у л е н к о  В.В. и др. Влияние растения-хозяина на генетическое разнообразие природной популяции Sinorhizobium meliloti. Генетика, 1999, 35(10): 1169-1177.
7. B e r i n g e r  J.E. R-factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol., 1974, 84: 188-198.
8. H i r s c h  P.R. Population dynamics of indigenous and genetically modified rhozobia in the field. New Phytol., 1996, 133: 159-171.
9. A l l e n  O.N. Experiments in soil bacteriology. 3-d ed. Minneapolis, 1959.
10. О н и щ у к  О.П.,  Ш а р ы п о в а  Л.А.,  К у р ч а к  О.Н. и др. Выявление генов Sinorhizobium meliloti, влияющих на синтез поверхностных полисахаридов и конкурентоспособность. Генетика, 2005, 41(12): 1617-1623.
11. З а т о в с к а я  Т.В.,  У ш а к о в  К.В.,  Ю р г е л ь  С.Н. и др. Получение Tn5-мутантов Rhizobium meliloti с измененным составом липополисахаридов и анализ их симбиотических свойств. Генетика, 1998, 34(6): 742-748.
12. Ч и ж е в с к а я  Е.П.,  К р о л ь  Е.А.,  О н и щ у к  О.П. и др. Физическое и генетическое картирование мутаций симбиотической эффективности на мегаплазмиде-2 штамма СХМ1 Rhizobium meliloti. Генетика, 1998, 9(34): 1220-1227.
13. Ф е д о р о в  С.Н.,  С и м а р о в  Б.В. Получение мутантов с измененными симбиотическими свойствами у Rhizobium meliloti под действием УФ-лучей. С.-х. биол., 1987, 9: 44-49.
14. А н д р о н о в  Е.Е.,  Р у м я н ц е в а  М.Л.,  С и м а р о в  Б.В. Генетическое разнообразие природной популяции Sinorhizobium meliloti, выявленное при анализе криптических плазмид и ISRm2011-2-фингерпринтов. Генетика, 2001, 37(5): 610-616.
15. Л а к и н  Г.Ф. Биометрия. Изд. 4-е. М., 1990.
16. C a s t r o - S o w i n s k i  S.,  M a r t i n e s - D r e t s  G.,  O k o n  Y. Laccase activity in melanin-production of Sinorhizobium meliloti. FEMS Microbiol. Letters, 2002, 209: 119-125.
17. G a l i b e r t  F.,  F i n a n   T.M.,  L o n g   S.R. e.a. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science, 2001, 293: 688-672.
18. M e r c a d o - B l a n c o  J.,  T o r o  N. Plasmids in rhizobia: the role of non-symbiotic plasmids. Molec. Plant-Microbe Interact.,1996, 9: 535-545.
19. Р у м я н ц е в а  М.Л.,  А н д р о н о в  Е.Е.,  С а г у л е н к о  В.В. и др. Нестабильность криптических плазмид у штамма Sinorhizobium meliloti P108 в процессе симбиоза его с люцерной Medicago sativa. Генетика, 2004, 40(4): 454-461.

 

VARIABILITY OF Sinorhizobium meliloti STRAINS FOR THE PROPERTIES DETERMINING THE SAPROPHYTIC SURVIVAL AND SYMBIOTIC EFFICIENCY UNDER THE SALINITY CONDITIONS

O.P. Onishchuk, M.L. Rumyantseva, N.A. Provorov, B.V. Simarov

Alfalfa root nodule bacteria (Sinorhizobium meliloti) from the soil populations of China and Siberia were studied for the range of properties essential for the saprophytic survival and for symbi-otic properties expressed in the absence of salinity or in the presence of 0,6% NaCl added into the media for alfalfa (Medicago sativa) growth. The significant differences between populations were re-vealed for bacterial polysaccharide content, for melanin production and for resistance to antibiotics. In the absence of NaCl the majority of strains were effective in symbiosis with alfalfa while under the salinity only two effective strains were revealed. The results of tube tests demonstrated that the genetic variation of rhizobia strains is no less essential for the symbiotic efficiency than the salt stress suggesting a possibility to overcome its negative impacts on plants by the microsymbiont breeding.

Key words: nodule bacteria, alfalfa, salt stress, symbiotic effectiveness, cryptic plasmids, resistance to antibiotics.

 

ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, 196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3, e-mail: olony@yandex.ru, genet@riam.spb.ru

Поступила в редакцию 10 октября 2008года

 

Оформление электронного оттиска

От эксперимента — к практике Всероссийский НИИ селекции и семеноводсва овощных культур Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Всероссийский НИИ cельскохозяйственной биотехнологии РАСХН Биотехнический научно-экспериментальный комплекс "ГосНИИсинтезбелок"